一种DNA串联重复单元的拆分组装方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种DNA串联重复单元的拆分组装方法。本发明专利技术通过对串联重复序列进行拆分、组装，以较少的DNA模板量可实现高效的体外组装；无需对组装结果进行扩增，反应得到的为环形重组质粒，可直接转化受体细胞完成克隆，无需酶切、纯化等后续处理步骤；反应过程不依靠DNA聚合酶扩增反应，不涉及复杂的重组过程，突变率低，反应效率和保真度高；反应体系简单，成本低，便于操作，可适用于各种DNA片段的组装，在串联重复单元的组装上具有明显优势。装上具有明显优势。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA串联重复单元的拆分组装方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种DNA串联重复单元的拆分组装方法。

技术介绍

[0002]DNA合成技术是合成基因组学，乃至现代分子生物学的根基,受当前合成技术的限制，双链DNA或目标基因组只能以短链oligo(寡聚核苷酸)的形式逐步拼接才能获得。PCR(聚合酶链式反应)或者酶切方法只限于获得自然界已有的DNA片段，而双链DNA的从头合成则需要通过oligo的拼接获得。除此以外，对于复杂的DNA序列，oligo往往需要经过合理的设计以减少oligo本身可能形成的二级结构等问题，以提高组装的效率。Repeat Splicer可以将用户输入的DNA序列按照用户自定义的参数拆分并设计成可组装的oligo，并通过评价序列退火温度、发卡结构及其退火温度等参数来输出最优结果，最大程度提高组装过程中的成功率。目前，通过oligo实现的DNA体外合成主要包括两类：
[0003](一)PCA技术：PCA技术通过将全长DNA序列打断为部分序列互补的寡核苷酸，通过退火、延伸及全长组装和扩增获得全长DNA片段的方法。过程如下：1)单链寡核苷酸末端序列互补，互为引物和模板；2)在嗜热DNA聚合酶作用下，经退火、延伸变成更长的双链DNA；3)与其他寡核苷酸片段或延伸产物变性、退火及延伸循环，见图4。
[0004]该方法需要寡核苷酸之间存在唯一、特异的互补序列。对于一个串联重复单元来说，PCA方法是可行的。但是当合成的DNA序列包含多个串联重复单元或oligo之间存在可能的错配或发卡结构时，PCA方法收到较大的限制。
[0005](二)连接酶链式组装：采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。过程如下：1)加入具有互补序列的寡核苷酸链、耐热DNA连接酶；2)加热，寡核苷酸链变性，解链；3)退火，寡核苷酸链彼此互补；4) DNA连接酶连接，见图5。
[0006]与PCA方法类似，该方法需要待组装的DNA序列在两端具有特异的同源序列，并且由于要求序列完全互补，对于序列非同源性的要求更高，在包含多个同源序列的DNA组装中存在困难。
[0007]单链oligo之间在退火形成双链后需要使用DNA连接酶进行连接及组装，这要求oligo的5
’
端具有磷酸基团。由于目前化学合成的oligo的两端均为羟基，往往需要对oligo进行磷酸化。为实现对oligo 5
’
端的特异性磷酸化，目前成熟的技术主要使用T4 PNK酶来实现。在本专利技术在采用此方法实现oligo的磷酸化过程。
[0008]总之，目前成熟的DNA体外组装方法受限于同源臂的特异性或组装效率，无法实现大规模的串联重复序列的体外组装。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术提供了一种DNA串联重复单元的拆分组装方法，该方法可现大规模的串联重复序列的体外组装，反应体系简单，成本低，便于操作。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]一种DNA串联重复单元的拆分组装方法，包括：
[0012]步骤1：在目标序列的5
’
端依次加入XhoI的切割碱基、XhoI补充碱基、 BsaI识别序列及BsaI切割间隔碱基；在其3
’
端依次加入切割间隔碱基、BsaI 反向识别序列、XbaI补充碱基及XbaI切割碱基，获得待拆分序列；
[0013]步骤2：采用k
‑
mer方法对待拆分序列进行分析，按照5
’
到3
’
的顺序依次获得长度为kbp的分析单元D1～D
n
；其中，k为大于0的任意帧数；n为所有分析单元的个数，n＞1；
[0014]步骤3：判断分析单元D1～D
n
中是否存在发卡结构，如果存在发卡结构，记录发卡结构的位置，并按照如下公式计算发卡结构的退火温度T
m
；
[0015][0016]其中，[Na
+
]为Na
+
离子浓度；[GC]为发卡结构的GC含量，所述GC含量为发卡结构中GC碱基数占所述发卡结构的碱基总数的比例；length为发卡结构的长度，即碱基总数；
[0017]步骤4：以拆分长度为L bp对步骤1所述的待拆分序列按照5
’
到3
’
端的顺序依次进行拆分、判定，依次获得拆分单元C1～Cm；其中，L为用户自定义的拆分长度，m为拆分单元的个数，m＞1；
[0018]以获得第一个拆分单元C1为例，假设将以拆分长度为Lbp对步骤1所述的待拆分序列按照5
’
到3
’
端的顺序拆分获得的第一个拆分单元为拆分单元1
‑
1，判定是否保留拆分单元1
‑
1，如果保留拆分单元1
‑
1，则将其标记为拆分单元C1；
[0019]所述判定的方法包括：
[0020]首先根据步骤3获得的发卡结构的位置，判断拆分单元1
‑
1中是否存在发卡结构；当拆分单元1
‑
1中不存在发卡结构时，直接保留该拆分单元1
‑
1，标记为拆分单元C1，然后以L bp的拆分长度对剩余待拆分序列继续进行拆分；当拆分单元1
‑
1中存在发卡结构时，按照以下方法对拆分单元1
‑
1进行处理：
[0021]1)按照如下公式计算拆分单元1
‑
1的退火温度T
m
’
；
[0022]T
m
’
=81.5+16.6
×
log
10
[Na
+
]+0.41
×
([GC]‑
600/length)
[0023]其中，[Na
+
]为Na
+
离子浓度，[GC]为拆分单元的GC含量，length为拆分单元的长度；
[0024]2)将步骤1)计算的T
m
’
与步骤3记录的所述拆分单元1
‑
1中最大发卡结构的T
m
进行比较：
[0025]①
、T
m
’
≥1.5T
m
时，则该拆分单元1
‑
1满足拆分要求，保留该拆分单元1
‑
1，标记为拆分单元C1，然后以L bp的拆分长度对剩余待拆分序列继续拆分；
[0026]②
、T
m
’
＜1.5T
m
时，则不满足拆分要求，以L+1 bp的拆分长度对待拆分序列重新进行拆分，获得新的第一个拆分单元，拆分单元1
‑
2；
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA串联重复单元的拆分组装方法，包括：步骤1：在目标序列的5
’
端依次加入XhoI的切割碱基、XhoI补充碱基、BsaI识别序列及切割间隔碱基；在其3
’
端依次加入切割间隔碱基、BsaI反向识别序列、XbaI补充碱基及XbaI切割碱基，获得待拆分序列；步骤2：采用k
‑
mer方法对待拆分序列进行分析，按照5
’
到3
’
的顺序依次获得长度为kbp的分析单元D1～D
n
；其中，k为大于0的任意帧数；n为所有分析单元的个数，n＞1；步骤3：判断分析单元D1～D
n
中是否存在发卡结构，如果存在发卡结构，记录发卡结构的位置，并按照如下公式计算发卡结构的退火温度T
m
；其中，[Na
+
]为Na
+
离子浓度；[GC]为发卡结构的GC含量，所述GC含量为发卡结构中GC碱基数占所述发卡结构总碱基数的比例；length为发卡结构的长度；步骤4：以拆分长度为Lbp对步骤1所述的待拆分序列按照5
’
到3
’
端的顺序依次进行拆分、判定，依次获得拆分单元C1～Cm；其中，L为用户自定义的拆分长度，m为拆分单元的个数，m＞1；以获得第一个拆分单元C1为例，假设将以拆分长度为Lbp对步骤1所述的待拆分序列按照5
’
到3
’
端的顺序拆分获得的第一个拆分单元为拆分单元1
‑
1，判定是否保留拆分单元1
‑
1，如果保留拆分单元1
‑
1，则将其标记为拆分单元C1；所述判定的方法包括：首先根据步骤3获得的发卡结构的位置，判断拆分单元1
‑
1中是否存在发卡结构；当拆分单元1
‑
1中不存在发卡结构时，则满足拆分要求，直接保留该拆分单元1
‑
1，并标记为拆分单元C1，然后以Lbp的拆分长度对剩余待拆分序列继续进行拆分；当拆分单元1
‑
1中存在发卡结构时，按照以下方法对拆分单元1
‑
1进行处理：1)按照如下公式计算拆分单元1
‑
1的退火温度T
m
’
；T
m
’
＝81.5+I6.6
×
log
10
[Na
+
]+0.41
×
([GC]
‑
600/length)其中，[Na
+
]为Na
+
离子浓度，[GC]为拆分单元的GC含量，length为拆分单元的长度；2)将步骤1)计算的T
m
’
与步骤3记录的所述拆分单元1
‑
1中最大发卡结构的T
m
进行比较：
①
、T
m
’
≥1.5T
m
时，则该拆分单元1
‑
1满足拆分要求，保留该拆分单元1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，谢泽雄，殷振宁，赵昊乾，高峰，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：