一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法技术

本发明专利技术提供了一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，所述方法包括如下步骤：(1)接种羊成纤维细胞，利用基础培养基进行一次培养；(2)去除基础培养基，换用诱导培养基进行二次培养，所述诱导培养基中含有小分子化合物，所述小分子化合物包括CHIR99021、Forsklin或Repsox中的任意一种或至少两种的组合；(3)去除诱导培养基，换用分化培养基进行三次培养，即得。本发明专利技术的方法成功实现了诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管，不涉及转入外源基因，无需先诱导成纤维细胞重编程为多能干细胞，再分化得到肌管，操作方便，易于标准化，获得的肌管安全性好。得的肌管安全性好。得的肌管安全性好。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法。

技术介绍

[0002]骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中具有干性的一类细胞，对动物的肌肉生长发育和再生具有关键作用，也是目前细胞培养肉(利用细胞培养工程和组织工程等技术，在体外培养动物肌肉组织作为食用材料)的种子细胞之一。
[0003]当前有多项与鸡、猪、羊、牛等动物的骨骼肌卫星细胞分离相关的专利报道，但都存在诸如问题，例如：1、分离得到的骨骼肌卫星细胞在体外培养容易失去增殖和分化形成肌管的能力，2、由于骨骼肌卫星细胞在肌肉中含量少，这些方法每次只能分离得到极少细胞，提取效率低。因此，这种单纯依靠分离动物肌肉中的骨骼肌卫星细胞诱导分化获得大量肌管，从而得到大量细胞培养肉的策略，仍面临巨大挑战。
[0004]另一种解决方案是通过诱导多能干细胞往肌肉祖细胞方向分化，再进一步分化得到肌管。但是该方法诱导时间过长，操作复杂，且多能干细胞的来源也是一大难题。因此，不经历多能干细胞阶段，直接将成纤维细胞转分化为肌管更具优势。有研究基于小鼠试验通过在成纤维细胞中过表达Myod1基因，获得肌管，但这一操作需要应用转基因技术，存在安全风险。
[0005]因此，如何提供一种操作简便、易于标准化、安全性高、无需转入外源基因、无需经历多能干细胞阶段，直接将成纤维细胞转分化为肌管的方法，成为了本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，所述方法包括如下步骤：
[0009](1)接种羊成纤维细胞，利用基础培养基进行一次培养；
[0010](2)去除基础培养基，换用诱导培养基进行二次培养，所述诱导培养基中含有小分子化合物，所述小分子化合物包括CHIR99021、Forsklin或Repsox中的任意一种或至少两种的组合；
[0011](3)去除诱导培养基，换用分化培养基进行三次培养，即得。
[0012]优选地，所述小分子化合物包括CHIR99021、Forsklin和Repsox。
[0013]优选地，所述诱导培养基中还含有bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和/或维生素C。
[0014]优选地，所述诱导培养基中的组分以浓度计包括DMEM 70
‑
90％w/w、血清替代物5
‑
15％w/w、FBS 5
‑
15％w/w、bFGF 5
‑
15ng/mL、维生素C 40
‑
60μg/mL、CHIR99021 1
‑
5μM、Forsklin 5
‑
50μM和Repsox 5
‑
50μM。
[0015]本专利技术所述w/w是指质量比。
[0016]上述70
‑
90％中的具体数值例如70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％等。
[0017]上述5
‑
15％中的具体数值例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
[0018]上述5
‑
15ng/mL中的具体数值例如5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL等。
[0019]上述40
‑
60μg/mL中的具体数值例如40μg/mL、42μg/mL、44μg/mL、46μg/mL、48μg/mL、50μg/mL、52μg/mL、54μg/mL、56μg/mL、58μg/mL、60μg/mL等。
[0020]上述1
‑
5μM中的具体数值例如1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM等。
[0021]上述5
‑
50μM中的具体数值例如5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM等。
[0022]优选地，所述基础培养基中含有DMEM、双抗和FBS。
[0023]本专利技术所述双抗是指青霉素和链霉素混合物。
[0024]优选地，所述基础培养基以质量百分含量计包括DMEM 84
‑
94％、双抗0.5％
‑
1.5％和FBS 5
‑
15％。
[0025]上述84
‑
94％中的具体数值例如84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等。
[0026]上述0.5％
‑
1.5％中的具体数值例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等。
[0027]上述5
‑
15％中的具体数值例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
[0028]优选地，所述分化培养基为含有马血清的DMEM/F12培养基。
[0029]优选地，所述马血清在分化培养基中的质量百分含量为1.5
‑
2.5％，例如1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％等。
[0030]优选地，所述一次培养、二次培养和三次培养的温度各自独立地为35
‑
40℃，例如35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃等。
[0031]优选地，所述一次培养的时间为0.5
‑
1.5天。
[0032]优选地，所述二次培养的时间为4
‑
7天。
[0033]优选地，所述三次培养的时间为2
‑
4天。
[0034]上述0.5
‑
1.5天中的具体数值例如0.5天、1天、1.5天等。
[0035]上述4
‑
7天中的具体数值例如4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天等。
[0036]上述2
‑
4天中的具体数值例如2天、2.5天、3天、3.5天、4天等。
[0037]优选地，所述接种是指接种在明胶包被的细胞培养板上。
[0038]本专利技术所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值
范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)接种羊成纤维细胞，利用基础培养基进行一次培养；(2)去除基础培养基，换用诱导培养基进行二次培养，所述诱导培养基中含有小分子化合物，所述小分子化合物包括CHIR99021、Forsklin或Repsox中的任意一种或至少两种的组合；(3)去除诱导培养基，换用分化培养基进行三次培养，即得。2.如权利要求1所述的诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其特征在于，所述小分子化合物包括CHIR99021、Forsklin和Repsox。3.如权利要求1或2所述的诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其特征在于，所述诱导培养基中还含有bFGF和/或维生素C。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其特征在于，所述诱导培养基中的组分以浓度计包括DMEM 70
‑
90％w/w、血清替代物5
‑
15％w/w、FBS 5
‑
15％w/w、bFGF 5
‑
15ng/mL、维生素C 40
‑
60μg/mL、CHIR99021 1
‑
5μM、Forsklin 5
‑
50μM和Repsox 5
‑
50μM。5.如权利要求1
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：郑勇，赖良学，叶升，
申请(专利权)人：超技良食深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：