一种成纤维细胞制备方法及应用技术

本发明专利技术属于成纤维细胞制备技术领域，公开了一种成纤维细胞制备方法及应用。本发明专利技术通过胰蛋白酶制备方法将提取的胰蛋白酶纯化，得到较高纯度的胰蛋白酶；可以大大促进成纤维细胞的生成；同时，通过成纤维细胞培养基制备方法制备的成纤维细胞培养基是经过大量科学实验获得的，培养基中硫酸皮肤素(DS)为二糖聚合物，是动物体内分布最广泛的一种细胞外基质糖胺多糖。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。本发明专利技术培养基能够促进成纤维细胞的增殖和贴壁粘附。贴壁粘附。贴壁粘附。

【技术实现步骤摘要】
一种成纤维细胞制备方法及应用


[0001]本专利技术属于成纤维细胞制备
，尤其涉及一种成纤维细胞制备方法及应用。

技术介绍

[0002]成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。体外培养的成纤维细胞多为梭形、多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达。它具有较强的分裂增殖能力，适应性强，是最容易培养的动物细胞类型之一；然而，现有成纤维细胞制备方法及应用制备过程中采用的胰蛋白酶含有杂质，影响成纤维细胞生成；同时，现有培养基对成纤维细胞的增殖效果差。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0004](1)现有成纤维细胞制备方法及应用制备过程中采用的胰蛋白酶含有杂质，影响成纤维细胞生成。
[0005](2)现有培养基对成纤维细胞的增殖效果差。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种成纤维细胞制备方法及应用。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种成纤维细胞的制备方法包括：
[0008]步骤一，无菌条件下取皮肤组织，将皮肤组织进行清洗并切割；去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:2加入0.26％胰蛋白酶和0.03MEDTA，5℃过夜处理；
[0009]步骤二，将处理后的皮肤组织均匀平铺到培养皿中，加入成纤维细胞培养基，置于37.5℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱内进行进行原代细胞培养；待细胞汇合度达到81％后，用胰蛋白酶消化除去上皮细胞，进而用成纤维细胞培养基终止消化，并传代培养，即得成纤维细胞。
[0010]进一步，所述皮肤组织取自人耳后，并且所述自体皮肤组织是是用直径为3.6mm的皮肤打孔器进行取样的。
[0011]进一步，所述皮肤组织是用含有2％青链霉素混合溶液的生理盐水进行清洗的。
[0012]进一步，所述培养皿是用1.6ml、质量体积比为0.5％的基底膜基质包被过夜处理过的。
[0013]进一步，所述胰蛋白酶制备方法如下：
[0014](1)取胰蛋白酶粗品，加水溶解，调节pH，搅拌；加入硫酸铵，溶解，静置；过滤，滤饼加水，搅拌溶解，调节pH，加入饱和硫酸铵溶液，静置；过滤，滤液中加入饱和硫酸铵溶液，静
置；
[0015](2)将上清液弃去，抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，滤饼待活化；将滤饼溶于盐酸溶液，加入氯化钙溶液及硼酸缓冲液，再加水，调节pH，最后加入结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液静置；
[0016](3)将活化后的溶液调节pH，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置，过滤，滤液加入固体硫酸铵，静置，过滤，得滤饼；滤饼中加入硼酸缓冲液，调节pH，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中；过滤得结晶物，加水溶解，调节pH；将溶液透析，去除杂质；取出透析液，抽滤，得滤液，调节pH，冻干后得结晶胰蛋白酶成品。
[0017]进一步，所述胰蛋白酶粗品用水溶解，粗品与水的重量比为1：2
‑
1：4，调节pH至3.0
±
0.5，搅拌10～16小时；每升溶液加入400～500g固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10～16小时。
[0018]进一步，所述称取滤饼重量，加水的重量为滤饼重量的2～4倍，搅拌溶解后，调节pH至3.0
±
0.4，加入滤饼重量1～3倍的饱和硫酸铵溶液，静置10～16小时。
[0019]进一步，所述量滤液体积，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，静置10～16小时。
[0020]进一步，所述成纤维细胞培养基制备方法如下：
[0021]1)按重量份数称取谷氨酰胺1份、脂类浓缩剂2份、抗氧化剂3份、DMEM/F12基础培养基干粉15份、重组白蛋白16份、柠檬酸铁铵6份、环庚三烯酚酮1份、硫酸皮肤素2份、卵磷脂1份、黄芪多糖21份、亚硒酸钠2份、维生素E 2份；溶于40
‑
45℃900mL超纯水中，搅拌至均匀得溶液I；
[0022]2)将溶液I冷却后，加入胰岛素4份、地塞米松6份、谷氨酰胺9份；搅拌均匀，用超纯水定容至1L，得溶液II；
[0023]3)将溶液II用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2，得溶液III；
[0024]4)将溶液III用0.2μm滤膜正压过滤除菌，即得。
[0025]进一步，所述溶液I冷却至21℃。
[0026]结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0027]第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0028]本专利技术通过胰蛋白酶制备方法将提取的胰蛋白酶纯化，得到较高纯度的胰蛋白酶；可以大大促进成纤维细胞的生成；同时，通过成纤维细胞培养基制备方法制备的成纤维细胞培养基是经过大量科学实验获得的，培养基中硫酸皮肤素(DS)为二糖聚合物，是动物体内分布最广泛的一种细胞外基质糖胺多糖。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。柠檬酸铁铵和环庚三烯酚酮相结合能够促进铁地运输，可替代转铁蛋白；重组白蛋白由重组酵母生产得到，对细胞生长起重要的促进作用。胰岛素，地塞米松属于糖皮质激素，在本专利技术培养基浓度范围内对成纤维细胞起增殖促进作用。本专利技术培养基能够促进成纤维细胞的增殖和贴壁粘附。
[0029]第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本专利技术所要保护的技术方案
具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0030]本专利技术通过胰蛋白酶制备方法将提取的胰蛋白酶纯化，得到较高纯度的胰蛋白酶；可以大大促进成纤维细胞的生成；同时，通过成纤维细胞培养基制备方法制备的成纤维细胞培养基是经过大量科学实验获得的，培养基中硫酸皮肤素(DS)为二糖聚合物，是动物体内分布最广泛的一种细胞外基质糖胺多糖。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。柠檬酸铁铵和环庚三烯酚酮相结合能够促进铁地运输，可替代转铁蛋白；重组白蛋白由重组酵母生产得到，对细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞的制备方法包括以下步骤：步骤一，无菌条件下取皮肤组织，将皮肤组织进行清洗并切割；去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:2加入0.26％胰蛋白酶和0.03MEDTA，5℃过夜处理；步骤二，将处理后的皮肤组织均匀平铺到培养皿中，加入成纤维细胞培养基，置于37.5℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱内进行进行原代细胞培养；待细胞汇合度达到81％后，用胰蛋白酶消化除去上皮细胞，进而用成纤维细胞培养基终止消化，并传代培养，即得成纤维细胞。2.如权利要求1所述成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述皮肤组织取自人耳后，并且所述自体皮肤组织是是用直径为3.6mm的皮肤打孔器进行取样的。3.如权利要求1所述成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述皮肤组织是用含有2％青链霉素混合溶液的生理盐水进行清洗的。4.如权利要求1所述成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述培养皿是用1.6ml、质量体积比为0.5％的基底膜基质包被过夜处理过的。5.如权利要求1所述成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶制备方法如下：(1)取胰蛋白酶粗品，加水溶解，调节pH，搅拌；加入硫酸铵，溶解，静置；过滤，滤饼加水，搅拌溶解，调节pH，加入饱和硫酸铵溶液，静置；过滤，滤液中加入饱和硫酸铵溶液，静置；(2)将上清液弃去，抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，滤饼待活化；将滤饼溶于盐酸溶液，加入氯化钙溶液及硼酸缓冲液，再加水，调节pH，最后加入结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液静置；(3)将活化后的溶液调节pH，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置，过滤，滤液加入固体硫酸铵，静置，过滤，得滤饼；滤饼中加入硼酸缓冲液，调节pH，搅拌均匀，再将溶液装透析袋...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘与之，张娴，夏碧菡，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：