一种基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法，属于细胞生物学技术领域。制备一定粗糙度的培养基底，粗糙基底可以通过生物矿化、物理打磨、化学侵蚀、物理沉积、化学沉积、离子沉积或非生物活性物质修饰制备得到，提取脂肪组织中的单个脂肪细胞，将提取的脂肪细胞和制备的粗糙基底实现接触培养，对接触培养的脂肪细胞去分化状况进行实时观察，待脂肪细胞完全去分化成干细胞样细胞时，消化收集细胞并保存备用。消化收集细胞并保存备用。消化收集细胞并保存备用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学
，更具体地，涉及一种基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法。

技术介绍

[0002]去分化脂肪(Dedifferentiated fat，DFAT)细胞是由人体内含量最丰富的成熟脂肪细胞经体外“天花板”法培养去分化而来。DFAT细胞在特定的培养条件下能够分化成脂肪细胞，骨细胞，心肌细胞和神经细胞等多种类型细胞。DFAT细胞具有较低的免疫原性，为同种异体移植脂肪干细胞提供了条件。由于DFAT细胞比骨髓来源的间充质干细胞更容易大批量获得，且比脂肪间充质干细胞纯度更高，DFAT细胞已成为组织工程理想的细胞来源，在组织细胞的修复，促进细胞的再生，肿瘤治疗等过程中发挥着巨大的作用。此外DFAT在丰胸、除皱等美容和整形行业有广泛的应用前景。因此，如何将成熟脂肪细胞在体外更好更快的培养到去分化状态的细胞成为目前研究的新的发展方向。
[0003]目前获得DFAT细胞的主要方式是利用成熟脂肪细胞具有浮力，而去分化后的脂肪细胞恢复其贴壁能力的特点在培养瓶中对其进行去分化培养。传统的去分化脂肪细胞培养主要是将脂肪细胞加入到培养瓶中，灌满培养液后倒置培养，该方法也称“天花板”培养法。天花板培养法虽然操作简单但是周期长且耗资大，成熟的脂肪细胞在培养瓶中贴壁完全去分化需耗时一个月左右，极大拉长了细胞获取周期从而降低了临床转化效率。而且在培养过程中需要将整个培养瓶都充满培养液，在造成资源浪费的同时，不利于细胞进行气体交换和生长，操作过程中还容易出现漏液，加大了细胞污染的危险。
[0004]针对以上难点，本专利技术提出一种基于培养基底表面粗糙度加速获取去分化脂肪细胞的方法，本专利技术通过胶原蛋白酶消化提取脂肪组织中的脂肪细胞，可以在非封闭的培养器皿中通过与粗糙表面共培养加速获取去分化脂肪细胞，整个过程只需要15天左右，去分化的脂肪细胞均一性好，且具有多项分化潜能，使用粗糙基底与脂肪细胞共培养在增加脂肪细胞贴壁表面积的同时可以降低培养液的消耗。

技术实现思路

[0005]针对传统的去分化脂肪细胞获取方法，主要存在培养周期长，需要大量培养液，容易造成资源浪费，且不利于细胞进行气体交换和生长，无法满足实验和临床需求等问题。本专利技术提出一种基于培养基底表面粗糙度来加速获取去分化脂肪细胞的方法。
[0006]根据本专利技术的目的，提供了一种基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法，提取脂肪组织中的单个脂肪细胞，将提取的脂肪细胞和表面粗糙基底实现接触培养，所述表面粗糙基底用于使脂肪细胞加速去分化得到去分化的脂肪细胞；所述表面粗糙基底的粗糙度范围为0.1≤Ra≤50。
[0007]优选地，所述表面粗糙基底的粗糙度范围为3.2≤Ra≤12.5。
[0008]优选地，所述表面粗糙基底通过生物矿化、物理打磨、化学侵蚀、物理沉积、化学沉
积、离子沉积或非生物活性物质修饰制备得到。
[0009]优选地，所述生物矿化具体为：
[0010](1)在盖玻片上接种细胞，细胞生长后，用多聚甲醛固定；
[0011](2)吸出多聚甲醛溶液，再用缓冲液清洗；然后加入硅酸四乙酯溶液，在酸性条件下摇床培养，硅酸四乙酯在酸性条件下水解产生二氧化硅并沉积在细胞表面，使细胞表面的形貌固定；
[0012](3)吸出多余的硅酸四乙酯溶液，超纯水清洗后，采用浓度由低到高的乙醇逐级脱水处理；脱水完成后，吸出多余的溶液并风干；
[0013](4)将步骤(3)得到的中间产物进行烧制以除去细胞，得到能够反应细胞粗糙度的二氧化硅沉积物，即制备得到表面粗糙基底。
[0014]优选地，所述烧制的温度为300℃
‑
800℃。
[0015]优选地，所述物理打磨具体为：使用砂纸对载玻片进行打磨，得到表面粗糙基底。
[0016]优选地，所述表面粗糙基底的粗糙表面修饰有胶原。
[0017]优选地，所述接触培养具体为：向培养液中加入脂肪细胞，然后将表面粗糙基底的粗糙面朝下，使其与培养液接触，再放入培养箱中进行培养；待所述脂肪细胞在基底的粗糙面贴壁后，将基底翻转使粗糙面朝上继续培养。
[0018]总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
[0019](1)本专利技术与现有的天花板法相比较，使用粗糙的基底与脂肪细胞接触培养，加速了脂肪细胞去分化过程，缩短了获取去分化的脂肪细胞DFAT所需要的时间，在相同时间可获取较多的去分化的脂肪细胞DFAT细胞，更能满足临床应用和实验需求。
[0020](2)本专利技术使用粗糙基底以倒扣的方式与脂肪细胞接触培养，粗糙基底面的形状大小可自主选择，且可以将粗糙基底放置在六孔板，培养皿等培养器皿中，区别于天花板培养方法，只能放置于培养瓶中。
[0021](3)本专利技术使用粗糙基底以倒扣的方式与脂肪细胞接触培养，培养过程中只需要将粗糙基底用培养液覆盖即可，区别于天花板培养法，需要将培养瓶灌满培养液，在造成资源浪费的同时，不利于细胞进行气体交换和生长。
附图说明
[0022]图1为MDA
‑
MB
‑
231生物矿化基底制备示意图。
[0023]图2为使用粗糙基底与脂肪细胞接触培养制备大量去分化的脂肪细胞示意图。
[0024]图3为脂肪细胞和粗糙表面共培养过程图。
[0025]图4为共培养条件下脂肪细胞去分化状态图。
[0026]图5为去分化脂肪细胞成脂和成骨诱导验证图。
[0027]图6为去分化脂肪细胞干性Marker验证图。
具体实施方式
[0028]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并
不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0029]本专利技术基于培养基底表面粗糙度加速获取去分化脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
[0030](1)制备一定粗糙度的培养基底；
[0031](2)提取脂肪组织中的单个脂肪细胞；
[0032](3)使提取的脂肪细胞和制备的粗糙基底实现接触培养；
[0033](4)对接触培养的脂肪细胞进行实时观察；
[0034](5)去分化脂肪细胞的消化及收集。
[0035]通过使用本方法可以加速并且高效获取去分化的脂肪细胞，减少资源浪费的同时提高细胞制备效率，为后续去分化脂肪细胞的广泛应用创造了前提条件。
[0036]本专利技术提出一种基于培养基底表面粗糙度加速获取去分化脂肪细胞的方法，制备一定粗糙度的培养基底，提取脂肪组织中的单个脂肪细胞，将提取的脂肪细胞和制备的粗糙基底实现接触培养，对接触培养的脂肪细胞去分化状况进行实时观察，待脂肪细胞完全去分化成干细胞样细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法，其特征在于，提取脂肪组织中的单个脂肪细胞，将提取的脂肪细胞和表面粗糙基底实现接触培养，所述表面粗糙基底用于使脂肪细胞加速去分化得到去分化的脂肪细胞；所述表面粗糙基底的粗糙度范围为0.1≤Ra≤50。2.如权利要求1所述的基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法，其特征在于，所述表面粗糙基底的粗糙度范围为3.2≤Ra≤12.5。3.如权利要求1所述的基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法，其特征在于，所述表面粗糙基底通过生物矿化、物理打磨、化学侵蚀、物理沉积、化学沉积、离子沉积或非生物活性物质修饰制备得到。4.如权利要求3所述的基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法，其特征在于，所述生物矿化具体为：(1)在盖玻片上接种细胞，细胞生长后，用多聚甲醛固定；(2)吸出多聚甲醛溶液，再用缓冲液清洗；然后加入硅酸四乙酯溶液，在酸性条件下摇床培养，硅酸四乙酯在酸性条件下水解产生二氧化硅并沉积在细胞表面，使细胞表面的形貌固定；(3)吸出多余的硅酸四乙酯溶液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李一伟，刘笔锋，雷梦成，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：