一种分子印迹及包覆聚合物、其制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种通过两次分子印迹制备该分子印迹及包覆聚合物的方法、得到的分子印迹及包覆聚合物以及该聚合物的用途。其中，所述分子印迹及包覆聚合物包括印迹层和包覆层。所述制备方法涉及使经过第一次印迹后得到的分子印迹材料与生物兼容性好的聚合试剂接触，以在所述分子印迹材料的印迹层上进行第二次印迹，形成包覆层。所述方法通过聚合试剂在印迹层表面形成的厚度可控的包覆层，能够覆盖印迹空腔外的非特异性吸附位点以提高专一性，在去除模板后得到能高亲和力和高专一性识别目标蛋白质和多肽的分子印迹及包覆聚合物，而且具有可控、通用、便捷等优点，在分离纯化、生化分析、肿瘤细胞靶向识别和成像等领域具有重要的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种分子印迹及包覆聚合物、其制备方法及用途


[0001]本专利技术属于仿生分子识别材料和分子印迹
，涉及一种能专一识别特定目标物(例如蛋白质或多肽)的分子印迹及包覆聚合物，制备该分子印迹及包覆聚合物的可控、通用、便捷的方法，以及该分子印迹及包覆聚合物的用途。

技术介绍

[0002]抗体作为人体免疫系统中的最后一道防线，是生物体抵御病毒和微生物等有害物质入侵的重要武器，在生命科学研究领域中被广泛用于生物分子识别。然而，抗体存在着明显的局限性，其制备工艺复杂、成本高昂、筛选周期长，有时甚至无法得到。此外，抗体的稳定性和重复性也存在问题。因此，寻找抗体的替代物不仅具有重要科学意义，而且具有巨大的经济价值。
[0003]分子印迹聚合物(MIPs)[Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1972,11,341
‑
345；Nature1993,361,645
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647]是在模板存在下通过共聚反应合成的具有抗体结合性能的化学合成受体。与抗体相比，分子印迹聚合物具有制备简单、成本低廉、结构稳定、耐受各种恶劣环境等优点。因此，已被广泛应用于分离、传感、蛋白质组学、生物成像、控制药物释放和纳米医学等领域。尽管分子印迹技术已取得显著的进步，但传统的分子印迹技术仍存在内在缺陷。为了获得对模板分子的高特异性和强亲和力，通常需要采用能与模板分子相互作用的多种功能单体与交联剂聚合构建印迹空腔，所得印迹空腔在形状、大小和相互作用位点等方面刚好和模板分子互补，从而得到能高特异性和强亲和力的结合空腔。然而本专利技术人发现，由于印迹空腔外的非印迹表面也是由与印迹空腔的种类和比例相同的单体和交联剂构建，因而存在显著的非特异相互作用位点，在实际使用过程中会导致明显的交叉反应性。由此，传统的分子印迹聚合物无法同时提供最佳的亲和力和最佳的特异性，而是在二者之间折中。

技术实现思路

[0004]针对现有分子印迹技术中存在的上述技术问题，本专利技术人通过研究开发了一种可控、通用、便捷的分子印迹及包覆聚合物的制备方法，其中利用可控印迹技术以非特异相互作用微弱聚合试剂(例如原硅酸四乙酯)作为包覆试剂对分子印迹材料(包括通过常规分子印迹技术得到的分子印迹聚合物)表面进行包覆并参与模板印迹，由此形成一层薄的包覆层降低了印迹材料表面非印迹区域的非特异吸附，从而使得到的分子印迹及包覆聚合物的非特异相互作用位点显著降低，并同时提高了对靶分子的特异性和亲和力两者。
[0005]一方面，本专利技术提供了一种通过两次分子印迹制备分子印迹及包覆聚合物的方法，其中，所述方法包括：使经过第一次印迹后得到的分子印迹材料与生物兼容性好的聚合试剂接触，以在所述分子印迹材料的印迹层上进行第二次印迹，形成包覆层。
[0006]另一方面，本专利技术提供了一种分子印迹及包覆聚合物，包括：
[0007]印迹层，以及
[0008]包覆层，其中，所述包覆层位于所述印迹层的外表面上。
[0009]又一方面，本专利技术涉及上述的分子印迹及包覆聚合物在制备用于识别靶分子或靶细胞的制剂中的用途。
[0010]本专利技术的上述制备方法涉及如下两次印迹：第一次定向印迹涉及利用与模板分子相互作用的单体硅烷化试剂和交联剂对模板分子进行印迹处理，用于构建良好的印迹空腔，从而获得强亲和力和高特异性；第二次定向印迹(即，包覆印迹)涉及利用非特异相互作用微弱聚合试剂在分子印迹层表面形成厚度可控的包覆薄层，用于覆盖印迹层外的非特异作用位点，从而进一步提高专一性(特异性)，此外，由于包覆层引起印迹层对模板分子上更多氨基酸残基的空间匹配识别，也同时提高了亲和力。就这方面而言，目前尚未有类似文献和专利报道。
[0011]本专利技术的上述制备方法不需要提供或制备目标蛋白的纯品，而只需要知道蛋白质的氨基酸结构序列信息，即可利用化学合成手段获得糖化表位模板，通过对该糖化表位模板进行两次印迹，可制备得到特异性更高、亲和力更强的分子印迹及包覆聚合物。该方法具有普适性强、模板可通过固相合成容易获得、且基底材料种类不受限制等优点，是一种通用性好、应用性强的分子印迹及包覆聚合物制备技术。通过本专利技术上述方法制备的分子印迹及包覆聚合物能够特异性识别、结合和富集目标蛋白质及其表位。其中的印迹模板为糖化表位，而非完整的目标蛋白。本专利技术采用蛋白表位糖化处理，突破了表位选取的局限性，而且拓宽了基底材料的种类，与现有的蛋白质印迹技术相比，首次针对目标蛋白的表位序列采用不同种类和比例的单体硅烷化试剂和交联剂进行第一次定向印迹，然后采用非特异相互作用微弱聚合试剂进行第二次定向印迹(又称包覆印迹)，不仅显著提高了分子印迹材料的特异性，而且增强了亲和力。本专利技术所得的分子印迹及包覆聚合物可以识别蛋白质和多肽，不仅具有强的亲和力，而且具有高的专一性(特异性)，从而可以在亲和分离、生化分析、靶向识别和生物成像等领域中展现出良好的应用潜力。
附图说明
[0012]图1为本专利技术的示例性的制备分子印迹及包覆聚合物的方法的原理示意图。
[0013]图2示出了β2‑
微球蛋白(B2M)(a)、转铁蛋白(TRF)(b)和转铁蛋白受体蛋白(TfR)(c)的C端糖化表位的化学结构，甲胎蛋白(AFP)(d)和癌胚抗原(CEA)的N端糖化表位(e)的化学结构，以及C肽(C
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peptide)的C端糖化表位(f)和N端糖化表位(g)的化学结构。
[0014]图3为采用不同基底材料的分子印迹及包覆聚合物的透射电子显微镜(TEM)照片。其中a为实施例2中制备的分子印迹及包覆的磁纳米粒子的TEM照片，b为实施例7中制备的分子印迹及包覆的银纳米粒子的TEM照片，c为实施例9中制备的分子印迹及包覆的FITC掺杂的二氧化硅纳米粒子的TEM照片。
[0015]图4示出了硼酸功能化的磁纳米粒子对不同分析物的选择性，其中，分析物分别为腺苷和脱氧腺苷(a)；B2M、TRF和TfR的C端表位，AFP和CEA的N端表位以及它们相应的糖化表位(b)。
[0016]图5示出了在最优印迹时间下采用不同比例的单体硅烷化试剂和交联剂制备的B2M的C端表位单次印迹的磁纳米粒子的最优印迹因子(a)和B2M的C端表位分子印迹及包覆的磁纳米粒子(b)的最优印迹因子。
[0017]图6示出了在最优印迹时间下采用不同比例的单体硅烷化试剂和交联剂制备的B2M的C端表位单次印迹的磁纳米粒子(a)和B2M的C端表位分子印迹及包覆的磁纳米粒子(b)的亲和力。
[0018]图7为B2M的C端表位分子印迹及包覆的磁纳米粒子在肽段水平(a)和蛋白水平(b)的选择性。
[0019]图8为针对不同蛋白的C端表位，本专利技术的制备分子印迹及包覆聚合物的方法的通用性的考察结果，其中，分别示出由此制备的TRF的C端表位分子印迹及包覆的磁纳米粒子的印迹条件优化结果(a)及其在肽段水平(c)和蛋白水平(e)的选择性；TfR的C端表位分子印迹及包覆的磁纳米粒子的印迹条件优化结果(b)及其在肽段水平(d)和蛋白水平(f)的选择本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过两次分子印迹制备分子印迹及包覆聚合物的方法，其中，所述方法包括：使经过第一次印迹后得到的分子印迹材料与生物兼容性好的聚合试剂接触，以在所述分子印迹材料的印迹层上进行第二次印迹，形成包覆层。2.如权利要求1所述的方法，还包括：将印迹模板锚定至基底材料的表面上，然后加入一种或多种单体硅烷化试剂以及交联剂以在所述基底材料上进行所述第一次印迹，形成印迹层，得到包含所述印迹层的所述分子印迹材料；优选地，所述交联剂为原硅酸四乙酯或原硅酸四甲酯；优选地，所述聚合试剂为原硅酸四乙酯、原硅酸四甲酯或多巴胺；优选地，所述方法包括：(1)选择目标蛋白的C端或N端多肽序列作为表位进行糖化，得到糖化表位作为所述印迹模板；(2)对基底材料进行功能化处理，得到硼酸功能化的基底材料；(3)将所述印迹模板锚定至所述硼酸功能化的基底材料的表面上，得到模板锚定的基底材料；(4)向所述模板锚定的基底材料中加入一种或多种所述单体硅烷化试剂以及所述交联剂以进行所述第一次印迹，形成印迹层，得到包含所述印迹层的第一次定向印迹的分子印迹材料；(5)使所述第一次定向印迹的分子印迹材料与所述聚合试剂接触，以在所述印迹层上进行所述第二次印迹，形成包覆层，得到包含所述包覆层的第二次定向印迹的分子印迹材料；(6)对所述第二次定向印迹的分子印迹材料进行洗脱来去除所述印迹模板，得到分子印迹及包覆聚合物。3.如权利要求2所述的方法，其中，选择所述目标蛋白的C端或N端的9
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15个氨基酸残基的多肽序列作为所述表位；优选地，采用所述一种或多种单体硅烷化试剂以及所述交联剂对所述表位中的前6
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12个氨基酸残基进行所述第一次印迹，以得到所述第一次定向印迹的分子印迹材料；并且采用所述聚合试剂对所述表位中的后3
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6个氨基酸残基进行所述第二次印迹，以得到所述第二次定向印迹的分子印迹材料；优选地，通过固相合成得到所述目标蛋白的C端或N端的9
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15个氨基酸残基的多肽序列作为所述表位；优选地，选择所述目标蛋白的C端多肽序列作为所述表位，在所述多肽序列的末端连接赖氨酸的残基，然后所述赖氨酸的残基通过希夫碱反应与单糖结合进行所述糖化；或者，优选地，选择所述目标蛋白的N端多肽序列作为所述表位，所述多肽序列的起始氨基酸的氨基通过希夫碱反应与单糖结合进行所述糖化；优选地，所述单糖选自果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖或其任意混合物；优选地，所述目标蛋白选自B2M、TRF、TfR、AFP、CEA或C
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peptide。4.如权利要求2或3所述的方法，其中，所述基底材料为磁性纳米材料、银纳米材料和荧光素掺杂的二氧化硅纳米材料；优选地，所述基底材料为具有拉曼报告分子的银纳米粒子或FITC掺杂的二氧化硅纳米
粒子；优选地，所述拉曼报告分子为对巯基苯胺、对硝基苯硫酚或对巯基苯硼酸；优选地，采用取代硼酸对所述基底材料进行功能化处理。5.如权利要求2
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4中任一项所述的方法，其中，所述基底材料为磁性纳米材料或银纳米材料，通过如下步骤对所述基底材料进行功能化处理：(i)使所述基底材料与氨水和TEOS在醇溶液中反应，得到表面包硅的基底材料；(ii)使所述表面包硅的基底材料与APTES在醇溶液中反应，得到氨基功能化的基底材料；(iii)使所述氨基功能化的基底材料与取代硼酸和氰基硼氢化钠在醇溶液中反应，得到所述硼酸功能化的基底材料；或者优选地，所述基底材料为荧光素掺杂的二氧化硅纳米材料，通过如下步骤对所述基底材料进行功能化处理：(i
’
)使所述荧光素掺杂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘震，邢荣荣，郭展辰，张齐，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：