本发明专利技术公开了一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括预处理步骤与提纯步骤；所述预处理步骤将间充质干细胞经接种培养后，于能够保持细胞存活且不超过12℃的温度下饥饿培养至可提取状态，以提高间充质干细胞外泌体的分泌量；所述提纯步骤将预处理步骤所得可提取状态间充质干细胞分离提纯，得到间充质干细胞外泌体。本发明专利技术的适间充质干细胞外泌体的制备方法，通过对间充质干细胞的低温饥饿处理，可在较短时间内取得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体；根据电镜下观察得，相比现有技术产量显著提升。产量显著提升。产量显著提升。
【技术实现步骤摘要】
一种适于间充质干细胞外泌体制备的饥饿处理方法
[0001]本专利技术涉及生物医药的干细胞医药
，尤其涉及一种适于间充质干细胞外泌体制备的饥饿处理方法及其制备的间充质干细胞外泌体及其在在治疗肺部疾病药物方面的应用。
技术介绍
[0002]近年来，已经有许多研究表明了间充质干细胞在再生医学领域中具有广阔的应用前景，同时国际上也已经有干细胞新药获批上市。除了干细胞本身，源自于干细胞的外泌体也成为了医学届关注的热点，为疾病的治疗带来了新思路。
[0003]但是，外泌体制剂存在外泌体提取效率不高的弊端，这与间充质干细胞的来源稀少一同导致了外泌体产量难以满足试验与制药的需求。
技术实现思路
[0004]为了克服现有技术的上述缺点，本专利技术的目的是提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，旨在提升外泌体的整体制备效率。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括预处理步骤与提纯步骤；
[0007]所述预处理步骤将间充质干细胞经接种培养后，于能够保持细胞存活且不超过12℃的温度下饥饿培养至可提取状态，以提高间充质干细胞外泌体的分泌量；
[0008]所述提纯步骤将预处理步骤所得可提取状态间充质干细胞分离提纯，得到间充质干细胞外泌体。
[0009]作为一种改进方案，所述低温条件为2℃～8℃，优选4℃～6℃。
[0010]作为一种改进方案，所述低温条件饥饿培养时间为12h～24h。
[0011]作为一种改进方案，所述脐带间充质干细胞为传代培养至第4
‑
6代的脐带间充质干细胞，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度环境中恒温培养。
[0012]作为一种改进方案，所述脐带间充质干细胞是将脐带剥离脐动脉和脐静脉后，置于无血清完全培养基中，剪成组织块进行培养；待间充质干细胞(MSCs)从组织块爬出且融合度达到80％时，用胰酶消化得到所述脐带间充质干细胞。
[0013]作为一种改进方案，所述提纯步骤先进行低速离心再进行高速离心；
[0014]所述低速离心将预处理所得上清液于2000
‑
10000g转速下离心10
‑
40min，弃沉淀物，收集上清液，以去除死细胞、大碎片、细胞器及小颗粒；
[0015]所述高速离心将上清液于110,000g转速下离心70
‑
140min，弃上清液，得到的沉淀即为外泌体；
[0016]所述低速离心再和高速离心在2
‑
6℃环境下进行，优选4℃。
[0017]前述方法制备得到的间充质干细胞外泌体，所述外泌体表达标志性蛋白CD63和Alix，且所述外泌体粒径为92
±
34.1nm。
[0018]前述间充质干细胞外泌体在治疗肺部疾病药物方面的应用，优选治疗慢性阻塞性肺疾病药物方面的应用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]1)本专利技术的适间充质干细胞外泌体的制备方法，通过对间充质干细胞的低温饥饿处理，可在较短时间内取得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体；根据电镜下观察得，相比现有技术产量显著提升。
[0021]2)制备过程中，离心提取步骤的离心温度为2
‑
10摄氏度，提高了提取过程中外泌体的生物学活性稳定性。
[0022]3)原代培养方法为组织块贴壁法，与酶消化法相比较操作简单、细胞纯度高、避免了消化酶对细胞对损伤、细胞活力高。细胞培养过程中采用无血清培养基，避免了血清中外泌体的干扰，提高了外泌体使用的安全性。
[0023]4)本专利技术间充质干细胞外泌体对慢性阻塞性肺损伤大鼠肺组织明显降低MDA含量，增强了SOD活性作用，明显降低IL
‑
1β、TNF
‑
α含量，对大鼠慢性阻塞性肺疾病具一定的治疗作用。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例的间充质干细胞(MSCs)100
×
倒置显微镜观察图。
[0025]图2为本专利技术实施例的间充质干细胞(MSCs)流式表型特征鉴定结果。
[0026]图3为本专利技术实施例的间充质干细胞成脂诱导分化鉴定结果。
[0027]图4为本专利技术实施例的间充质干细胞成骨诱导分化鉴定结果。
[0028]图5为本专利技术实施例的间充质干细胞成软骨诱导分化鉴定结果。
[0029]图6为本专利技术实施例的间充质干细胞外泌体对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影响图。
[0030]图7为本专利技术实施例的间充质干细胞外泌体对慢性阻塞性肺疾病大鼠细胞因子的影响图。
[0031]图8为用western
‑
blot法分析两种外泌体的标志性蛋白结果图。
[0032]图9为外泌体的形态透射电镜图。
[0033]图10为外泌体粒径检测结果图。
具体实施方式
[0034]现结合附图说明与实施例对本专利技术进一步说明：
[0035]实施案例1：
[0036]步骤1)分离培养人脐带间充质干细胞(MSCs)：
[0037]经产妇知情同意，采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带。脐带采集之前产妇需经过严格的病原体检测，包括梅毒螺旋体、艾滋病病毒、巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和支原体等微生物，确认安全后使用。
[0038]剪取近胎盘端脐带20
‑
30cm，置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中保存，4小时内使用。在生物安全柜内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液；75％酒精消毒30s；剥离脐动脉和脐静脉后，加入无血清完全培养基3
‑
5ml，用手术剪刀剪成
1
‑
3mm3左右的组织块；剪碎后的组织块均匀平铺于25cm2培养瓶，30
‑
60组织块/25cm2培养瓶；在37℃、5％CO2培养箱中培养；d1天、d4天补液：4ml/25cm2培养瓶；之后每2
‑
3天换液；待间充质干细胞(MSCs)从组织块爬出且融合度达到80％时(10
‑
16天)，用0.25％胰酶消化，传代至175cm2培养瓶中继续扩增培养，并记为第1代。以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。
[0039]原代培养方法为组织块贴壁法，与酶消化法相比较操作简单、细胞纯度高、避免了消化酶对细胞对损伤、细胞活力高。细胞培养过程中采用无血清培养基，避免了血清中外泌体的干扰，提高了外泌体使用的安全性。
[0040]步骤2)低温饥饿处理MSCs
[0041]取第4
‑
6代的MSCs接种于175cm2培养瓶中，37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养，待细胞融合达到60
‑
70％时，培养瓶转入2℃条件下培养，处理12小时。待细胞变圆，由贴壁状态转变为悬浮本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括预处理步骤与提纯步骤；所述预处理步骤将间充质干细胞经接种培养后，于能够保持细胞存活且不超过12℃的温度下饥饿培养至可提取状态，以提高间充质干细胞外泌体的分泌量；所述提纯步骤将预处理步骤所得可提取状态间充质干细胞分离提纯，得到间充质干细胞外泌体。2.如权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述低温条件为2℃～8℃，优选4℃～6℃。3.如权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述低温条件饥饿培养时间为12h～24h。4.如权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞为传代培养至第4
‑
6代的脐带间充质干细胞。5.如权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞是将脐带剥离脐动脉和脐静脉后，置于无血清完全培养基中，剪成组织块进行培养；待间充质干细胞(MSCs)从组织块爬出且融合度达到80％时，用胰酶消化得到所述脐带间充质干细胞。6.使用如权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张鲁，王翔宇，
申请(专利权)人：广州明宇泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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