一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞及其分化方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞及其分化方法和应用，涉及间充质干细胞技术领域。该分化方法包括：在含有WNT通路激活剂和Activin A的第一分化培养基中培养1

【技术实现步骤摘要】
一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞及其分化方法和应用


[0001]本专利技术涉及间充质干细胞
，具体而言，涉及一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞及其分化方法和应用。

技术介绍

[0002]目前以化学药物、生物药物、手术治疗为支柱的传统疗法仍无法解决许多疾病问题，而以干细胞技术为核心的再生医学正逐渐应用于临床，并显示出巨大潜力。相比于其他种类的干细胞，间充质干细胞(MSCs)具有低免疫原性(即主要组织相容性复合物MHC I在MSCs中低表达，MHC II在MSCs中无表达)的特征，因而MSCs更适合同种异体应用，已成为细胞治疗的理想候选物。
[0003]间充质干细胞(MSCs)具有用于组织工程和再生医学的多种治疗潜力，它不仅可直接分化成组织特异性细胞以修复伤口而且可通过释放抗炎细胞因子、抗凋亡因子和生长因子的旁分泌形式来刺激组织修复，可用于治疗多种疾病，包括炎症性疾病和自身免疫性疾病。
[0004]此外，目前现有文献中记载，MSCs可以治疗呼吸道疾病、消化道疾病、肝脏疾病、胰脏炎、结直肠炎等疾病。
[0005]尽管MSCs在治疗呼吸道和消化道疾病方面取得了积极结果，许多临床试验也已证明MSCs治疗是安全有效的，但这些研究的结果和结论仍存在很大差异。最合理的解释是：1)MSCs供体来源过于广泛，传统意义上，间充质干细胞来源于人体组织，主要来源包括骨髓和脂肪，也可从脐带血、胎盘、羊膜、牙髓等组织分离获得MSCs，从胚胎发育角度看，骨髓、脂肪、牙髓、脐带、胎盘、羊膜等来源于中胚层、外胚层或滋养层，而使用中胚层、外胚层或滋养层来源的MSCs并不一定适合内胚层(呼吸道器官和消化道器官的祖细胞)相关疾病；2)不同供体来源的MSCs的培养方案也存在较大差异。因此，对于产生用于治疗的均质且胚层匹配的MSCs则显得至关重要。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞及其分化方法和应用。
[0008]本专利技术是这样实现的：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法，其包括：
[0010]第一分化阶段：在含有WNT通路激活剂和Activin A的第一分化培养基中培养1
‑
2天诱导人多能干细胞向中内胚层细胞分化；
[0011]第二分化阶段：在不含WNT通路激活剂且含有Activin A的第二分化培养基中培养
2
‑
8天诱导形成定型内胚层细胞(DE)；
[0012]第三分化阶段：在MSC生成培养基中培养2
‑
4天诱导所述定型内胚层细胞获得中肠细胞、后肠细胞及前肠细胞的命运；
[0013]第四分化阶段：继续在MSC生成培养基中培养8
‑
14天诱导生成含有间充质干细胞的细胞群体；
[0014]第五分化阶段：进行消化传代2
‑
3次，即得定型内胚层细胞来源的间充质干细胞(DE
‑
MSCs)。
[0015]第二方面，本专利技术提供一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞，其采用如前述实施方式任一项所述的经人多能干细胞生成定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的方法分化获得。
[0016]第三方面，本专利技术提供如前述实施方式所述的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞在制备治疗肠道相关疾病的药物中的应用。
[0017]第四方面，本专利技术提供一种间充质干细胞分化细胞，其是由如前述实施方式所述的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞体外分化而成；
[0018]优选地，所述间充质干细胞所分化得到的细胞包括脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞中的至少一种。
[0019]第五方面，本专利技术提供一种诱导人多能干细胞生成定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的试剂盒，其包括实现如前述实施方式所述的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法的试剂。
[0020]本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本申请提供的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法采用成分清晰的培养基诱导hPSC分化成定型内胚层细胞(DE)和定型内胚层细胞特异性来源的间充质干细胞(DE
‑
MSCs)。更为重要的是，通过不同的诱导方式可以使这些细胞获得中肠、后肠及前肠细胞命运。经前肠细胞命运途径获得的DE
‑
MSCs类似于人体肺、肝脏及胰腺来源的MSCs，适用于治疗以COVID
‑
19、肝硬化、胰腺炎等为代表的体肺、肝脏及胰相关疾病；而经中肠/后肠细胞命运途径获得的DE
‑
MSCs类似于人体小肠及大肠来源的MSCs，适用于治疗以结肠炎、克罗恩氏病为代表的肠道相关疾病。本申请提供了一种高效制备经人多能干细胞衍生的定型内胚层来源的间充质干细胞的体外分化方法。且这些DE
‑
MSCs能够在体外刺激的条件下分泌抗炎因子，进一步地，这些经腹腔注射的DE
‑
MSCs具有治疗结肠炎小鼠的能力。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0023]图1为实施例1提供的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞(DE
‑
MSCs)的分化方案；
[0024]图2为实施例1中从第0天到第24天，细胞形态(上图)随时间进程的变化和定型内胚层细胞标志物SOX17(下图)的表达随时间进程的变化；
[0025]图3为实施例1中SOX17 mRNA和间充质干细胞特征性基因CD44、CD73、CD105 mRNA表达水平随时间进程的变化；
[0026]图4为实施例1中第24天时间充质干细胞标志物CD44、CD73、CD105、CD45阳性细胞百分比；
[0027]图5为实施例1中定型内胚层细胞标志物SOX17阳性细胞百分比以及间充质干细胞标志物CD44、CD73和CD105阳性细胞百分比；
[0028]图6为实施例1中定型内胚层细胞来源的间充质干细胞(DE
‑
MSCs)的细胞总数随时间进程的变化；
[0029]图7为实施例1中定型内胚层细胞来源的间充质干细胞(DE
‑
MSCs)进一步分化为脂肪细胞(可被油红O染料染成红色)、软骨细胞(可被Alcian蓝染料染成蓝色)、骨细胞(可被Von Kossa染料染成黑色)；
[0030]图8为实施例2提供的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞(DE
‑
MSCs)的分化方案示意图；
[0031]图9为实施例2中纯化的SOX17阳性DE细胞(仅选取表达强度最高的前48％的DE细胞，并将纯化得到的细胞返回到M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法，其特征在于，其包括：第一分化阶段：在含有WNT通路激活剂和Activin A的第一分化培养基中培养1
‑
2天诱导人多能干细胞向中内胚层细胞分化；第二分化阶段：在不含WNT通路激活剂且含有Activin A的第二分化培养基中培养2
‑
8天诱导形成定型内胚层细胞(DE)；第三分化阶段：在MSC生成培养基中培养2
‑
4天诱导所述定型内胚层细胞获得中肠细胞、后肠细胞和前肠细胞的命运；第四分化阶段：继续在MSC生成培养基中培养8
‑
14天诱导生成含有间充质干细胞的细胞群体；第五分化阶段：进行消化传代2
‑
3次，即得定型内胚层细胞来源的间充质干细胞(DE
‑
MSCs)。2.根据权利要求1所述的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法，其特征在于，在所述第二分化阶段结束后，还包括采用流式细胞分选技术来纯化所述定型内胚层细胞(DE)；优选地，纯化所述定型内胚层细胞(DE)包括：通过细胞消化液收获细胞，并用中和液进行中和，细胞经洗涤后重悬，通过流式细胞仪进行纯化。3.根据权利要求1或2所述的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法，其特征在于，在第三分化阶段的所述MSC生成培养基中加入细胞信号通路调节剂，优选地，所述细胞信号通路调节剂包括WNT通路激活剂、WNT通路抑制剂和TGF通路抑制剂中的至少一种。4.根据权利要求3所述的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法，其特征在于，所述WNT通路激活剂包括CHIR99021、CHIR99021
‑
HCl、Wnt3a配体、Wnt5a配体和BIO中的至少一种；所述WNT通路抑制剂包括XAV939、IWP2和IWR
‑
1中的至少一种；所述TGF通路抑制剂包括SB431542、RepSox、SD
‑
208、GW788388、A
‑
77
‑
01和A
‑
83
‑
01中的一种；优选地，所述WNT通路激活剂为处理浓度为1
‑
5μM的CHIR99021；优选地，所述WNT通路抑制剂为处理浓度为1
‑
10μM的XAV939；优选地，所述TGF通路抑制剂为处理浓度为1
‑
10μM的SB431542。5.根据权利要求1所述的定型内胚层细胞来源的间充质干细胞的分化方法，其特征在于，所述第一分化培养基是由基础组分加入所述WNT通路激活剂和所述Activin A获得的，所述第二分化培养基是由基础组分加入所述Activin A获得的；优选地，所述WNT通路激活剂为处理浓度为1
‑
5μM的CHIR99021
‑
HCl，所述Activin A的添加量为10
‑
100ng/ml；优选地，所述基础组分包括DMEM/F12、L
‑
抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国凯，张宇萌，徐仁和，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：