一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途，所述重组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，本发明专利技术用黄酮醇合酶MdFLS1催化方法可以高效、专一性的合成槲皮素和山奈酚。这是在国内外首次证明苹果黄酮醇合酶可以催化二氢槲皮素和二氢山奈酚分别生成槲皮素和山奈酚。本发明专利技术的公开为体外利用酶催化方法合成黄酮类物质提供了可行的方法，避免了用提取或化学合成方法获得黄酮类物质的低效率和专一性。学合成方法获得黄酮类物质的低效率和专一性。学合成方法获得黄酮类物质的低效率和专一性。

【技术实现步骤摘要】
一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]苹果(Malus domestica)是世界上四大栽培水果之一，而中国是世界上拥有最大的种植面积和水果产量的国家，可满足人口众多的广阔市场消费需求。随着人们生活水平的提高，对水果质量的期望更是日益增加，功能性水果对消费者越来越有吸引力。功能性水果富含某些特殊营养元素，具有很强的抗氧化或抗癌活性。因此，筛选优质苹果不仅有益于人民健康，而且可以增加种植者的收入。
[0003]黄酮类化合物的生物合成首先通过苯丙烷途径将苯丙氨酸转化为香豆酰-CoA，香豆酰-CoA再进入黄酮合成途径与3分子丙二酰CoA结合生成查尔酮，然后经过分子内的环化反应生成二氢黄酮类化合物。二氢黄酮是其他黄酮类化合物的主要前体物质，通过不同的分支合成途径，分别生成黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素等。植物类黄酮合成代谢主要有七大分支途径：花青素(Anthocyanins)途径、原花青素(Proanthocyanidins,PA)也就是浓缩丹宁(Condensed Tannins)途径、黄酮途径(Flavones)、黄酮醇(Flavonols)途径、异黄酮(Isoflavone)和异类黄酮(Isoflavonoids)途径、鞣酐(也叫鞣红,Phlobaphenes)途径、橙酮(Aurones)途径。
[0004]黄酮醇途径中，二氢黄酮类化合物能在黄烷醇-3-羟化酶(F3H)的作用下生成二氢槲皮素和二氢山萘酚等二氢黄酮醇类化合物，之后又在黄酮醇合酶(FLS)的作用下去饱和形成黄酮醇类化合物。黄酮醇合酶(FLS)是黄酮类化合物合成途径与儿茶素合成途径的桥梁，二氢黄酮醇能在FLS的作用下去饱和形成黄酮醇类化合物，如槲皮素和山萘酚。Xu等从银杏叶中克隆到了FLS基因，在大肠杆菌中该酶能将二氢山萘酚转化为山萘酚，同时该酶也能将柚皮素转化为山萘酚，该研究表明在黄酮类化合物合成途径中FLS是一个双功能酶。
[0005]近年来，随着对黄酮类化合物的研究深入，研究人员发现植物体内的黄酮类物质具有强抗氧化性，这些物质被人摄取后能清除自由基诱导的组织氧化损伤。另外这类物质还具有抗菌、抗病毒、抗骨质疏松、抗肿瘤等多种生物活性。因而在医药、化工领域有着重要的应用价值。除此外，黄酮类物质在农业上也有着重要的应用价值。例如，牧草中的黄酮类化合物含量过高会严重影响反刍动物的消化导致腹胀，而适量的黄酮类化合物能结合草料中的蛋白，使其不被反刍动物发酵，从而提高了植物蛋白转变成动物蛋白的效率。由此可见，对类黄酮代谢途径及其调控的研究意义十分重大。

技术实现思路

[0006]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种重组苹果黄酮醇合酶，所述重
组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术还提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述重组苹果黄酮醇合酶。
[0009]本专利技术还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述的多核苷酸。
[0010]本专利技术还提供一种酶蛋白表达系统，所述酶蛋白表达系统含有所述的核酸构建体或基因组中整合有所述多核苷酸的宿主细胞。
[0011]本专利技术还提供一种重组苹果黄酮醇合酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将所述核酸构建体转化至宿主细胞中，培养宿主细胞诱导重组苹果黄酮醇合酶表达。
[0012]本专利技术还提供所述的重组苹果黄酮醇合酶在制备黄酮醇类化合物中的用途。
[0013]本专利技术还提供一种黄酮醇类化合物的制备方法，所述方法包括：以二氢黄酮醇类化合物作为底物，向酶促反应体系中加入重组苹果黄酮醇合酶。
[0014]如上所述，本专利技术的重组苹果黄酮醇合酶及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本专利技术是在国内外首次证明苹果黄酮醇合酶可以催化二氢槲皮素和二氢山奈酚分别生成槲皮素和山奈酚。本专利技术的公开为体外利用酶催化方法合成黄酮类物质提供了可行的方法，避免了用提取或化学合成方法获得黄酮类物质的低效率和专一性。用重组黄酮醇合酶催化方法可以高效、专一性的合成槲皮素和山奈酚(见附图1至附图5)。本专利技术实施后将为槲皮素和山奈酚合成工业带来巨大经济效益。
附图说明
[0015]图1显示为纯化后的蛋白用SDS-PAGE检测结果图。其中，M为蛋白质分子量标记；序号1泳道为GST标签蛋白，作为对照；序号2泳道为MdFLS1-GST融合蛋白。
[0016]图2显示为纯化后的MdFLS1-GST融合蛋白催化二氢槲皮素生成形成槲皮素，催化产物用高效液相色谱(HPLC)分析结果图。其中Dihydroquercetin为对照组，即纯化的GST标签蛋白与二氢槲皮素的反应体系，无产物合成；MdFLS1-GST+Quercetin为实验组，即纯化的MdFLS1-GST融合蛋白与二氢槲皮素的反应体系，比只含有GST标签蛋白的对照反应体系多出了1个明显的产物峰，该产物被推测为槲皮素。
[0017]图3显示为二氢槲皮素的催化产物用质谱(LC-MS)鉴定。其中上图表示二氢槲皮素的标准质谱图，下图表示二氢槲皮素的催化产物的质谱图。两图特征峰相同，证明二氢槲皮素在酶的催化下形成了槲皮素。
[0018]图4显示为纯化后的MdFLS1-GST融合蛋白催化二氢山奈酚形成山奈酚，催化产物用高效液相色谱(HPLC)分析。其中Dihydrokaempferol为对照组，纯化的GST标签蛋白与二氢山奈酚的反应体系，无产物合成；MdFLS1-GST+Kaempferol为实验组，纯化的MdFLS1-GST融合蛋白与二氢山奈酚的反应体系，比只含有GST标签蛋白的对照反应体系多出了1个明显的产物峰，该产物即为山奈酚。
[0019]图5显示为二氢山奈酚的催化产物用质谱(LC-MS)鉴定。其中上图表示二氢山奈酚的标准质谱图，下图表示二氢山奈酚的催化产物的质谱图。两图特征峰相同，证明二氢山奈酚在酶的催化下形成了山奈酚。
具体实施方式
[0020]本专利技术提供一种重组苹果黄酮醇合酶，所述重组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0021]在一种实施方式中，所述重组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列具有与SEQ ID No.2至少80％、85％、90％、95％或99％以上的相似性。在一种实施方式中，所述重组苹果黄酮醇合酶还包括其功能性片段。所述功能性片段例如为标签蛋白。
[0022]生物体内编码所述重组苹果黄酮醇合酶的基因为苹果黄酮醇合酶基因MdFLS1。所述重组苹果黄酮醇合酶的分子量为36.85KD。通过BlastP和ScanProsite分析，所述重组苹果黄酮醇合酶在N端氨基酸序列的196位至296位含有典型的2-ODD保守基序。
[0023]本专利技术还提供一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组苹果黄酮醇合酶，其特征在于，所述重组苹果黄酮醇合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸编码权利要求1所述重组苹果黄酮醇合酶。3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括权利要求2或3所述的多核苷酸。5.一种酶蛋白表达系统，其特征在于，所述酶蛋白表达系统含有权利要求4所述的核酸构建体或基因组中整合有权利要求2所述多核苷酸的宿主细胞。6.一种重组苹果黄酮醇合酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将权利要求4所述核酸构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：李攀，冀芦沙，许钦招，
申请(专利权)人：聊城大学，
类型：发明
国别省市：