抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘技术

本发明专利技术提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，同时提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白杂抗体吸收工艺用醛化胎盘的制备方法。本发明专利技术制备方法改进了常规抗人T细胞猪免疫球蛋白的提纯步骤，尤其改进了杂抗体吸收工艺顺序、免疫球蛋白沉淀剂用量、成品保存条件等的工艺步骤，并创新的增加了对杂抗体吸收后制品的精制处理工艺，整体上能够获得制品得率明显提升，杂质显著降低，同时可以大幅提升制品稳定性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘


[0001]本专利技术涉及生物制品
，具体涉及一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法及其杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法。

技术介绍

[0002]抗人T细胞猪免疫球蛋白(P
‑
ATG)是一种疗效确切的免疫抑制剂，为历版国家《生物制品规程》、《中华人民共和国药典》收载的品种，主要用于临床器官移植的免疫排斥预防及治疗、骨髓移植的移植物抗宿主反应预防以及再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜及其它免疫性疾病等的治疗。
[0003]专利文献CN101311191A公开了一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法，该方法存在如下问题：
[0004]1、乙醇用量较大，且使用温度一般为不低于
‑
25℃，生产过程中能耗较高，且废液中含有大量乙醇，存在一定的安全隐患和潜在的污染风险。
[0005]2、杂抗体吸收工艺后缺少进一步纯化步骤，无法去除因加入醛化人红细、醛化胎盘、健康人血浆引入的纤维蛋白、脂蛋白等杂质成分，致使成品长期存放过程中，可能会出现蛋白轻微析出等现象，影响制品品质。
[0006]3、存在多次收集沉淀的步骤，收集后需对沉淀进行溶解即相应处理，方能进行后续操作，无法实现连续生产。
[0007]4、配制过程中，采用麦芽糖作为稳定剂，而成品中则采用甘氨酸作为稳定剂，需通过透析方式去除麦芽糖，增加了操作步骤，且残留的麦芽糖可能对糖尿病患者产生一定的影响。
[0008]5、成品pH值为中性，较接近免疫球蛋白的等电点(pI)，此条件下P
‑
ATG的溶解度较低，长期存放可能会出现蛋白凝集或析出现象，进而影响制品品质。
[0009]6、原工艺制品内包材采用低硼硅西林瓶。药用玻璃包装的首要质量标准是其耐水侵蚀的化学性能(耐水解性)。当与水或酸接触时，溶液中的一些氢离子会与玻璃中的钠离子进行交换。低硼硅玻璃具有较高的钠含量，从而导致较高的钠提取率和较低的耐水解性，对制品长时间保存存在潜在的风险。
[0010]7、工艺得率相对较低，100ml免疫猪血浆约可收获P
‑
ATG仅为375mg。

技术实现思路

[0011]基于此，有必要提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法及其杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法，可以显著提升制品的P
‑
ATG得率，并可提升制品稳定性。
[0012]本专利技术采用如下技术方案：
[0013]一种杂抗体吸收用醛化胎盘，其为采用甲醛含量0.8％～3％的醛化液醛化反应3～7h所制备的醛化人胎盘渣。所述杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法，包括如下步骤：
[0014]S1，获取内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻；
[0015]S2，将解冻后的人胎盘渣置于胎盘醛化液中进行醛化反应3～7h，所述胎盘醛化液为含0.8％～3％甲醛的磷酸盐缓冲液；
[0016]S3，将醛化反应完毕的胎盘转移至生理氯化钠溶液中洗涤，再转入中和液中进行中和反应1～3h，所述中和液为含0.5％～2％甘氨酸的氯化钠溶液；中和反应完毕后，将胎盘转移至生理氯化钠溶液中再次洗涤，控干，即得醛化人胎盘。
[0017]优选地，所述甲醛醛化液为含1％甲醛的磷酸盐缓冲液。
[0018]本专利技术还提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0019]S1，制备免疫猪血浆：经人胸腺细胞或健康人血液分离的人淋巴细胞免疫健康猪，经检验合格后采集、分离出免疫猪血浆。
[0020]S2，血浆合并及融浆：将解冻的免疫猪血浆按投浆所需进行混合，并置于不高于37℃条件下融浆，得混合猪血浆。
[0021]S3，健康人血浆吸收杂抗体：向混合猪血浆中加入健康人血浆，得料液A；
[0022]S4，低温乙醇初分离：向料液A中加入
‑
15℃以下的50％乙醇至其终浓度为8wt％，调整pH至7.0
±
0.5，保持反应温度在0～5℃，搅拌不短于1h，静置后分离，沉淀为组分I废弃，收集上清液B；向上清液B中加入
‑
15℃以下的50％乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0
±
0.5，保持反应温度在
‑
5～
‑
10℃，搅拌不短于1h，静置后分离，上液废弃清，收集沉淀为组分Ⅱ+Ⅱ；用0～4℃注射用水溶解组分Ⅱ+Ⅱ沉淀，加入固体氯化钠至终浓度为生理氯化钠溶液浓度，加入
‑
15℃以下的50％乙醇至其终浓度为17wt％，调整pH至5.0
±
0.5，保持反应温度在0～
‑
5℃，搅拌不短于1h，静置后分离，沉淀为组分Ⅱ废弃，收集上清液C；用生理氯化钠溶液对上清液C超滤脱醇并进行浓缩，得浓缩液D。
[0023]S5，醛化人红细胞和醛化人胎盘杂抗体吸收：向浓缩液D中加入醛化人红细胞，调整pH至7.0
±
0.5，保持反应温度在0℃～8℃，搅拌不短于6h，分离红细胞，收集上清液E。向上清液E中加入醛化人胎盘，调整pH至7.0
±
0.5，保持反应温度在0℃～8℃，搅拌不短于6h，分离胎盘渣，收上清液F；将上清液F超滤浓缩，得浓缩液G。
[0024]S6，低温乙醇精制：用注射用水稀释浓缩液G，加入固体氯化钠至终浓度为生理氯化钠溶液浓度，加入
‑
15℃以下的95％乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0
±
0.5，保持反应温度在
‑
5～
‑
10℃，搅拌不短于1h，静置后分离，上液废弃清，收集沉淀为组分Ⅱ，即得包含抗人T细胞猪免疫球蛋白的沉淀。
[0025]S7，中间品配制：将沉淀组分Ⅱ溶解，调整pH至4.0
±
0.2，用生理氯化钠溶液进行超滤浓缩，并加入甘氨酸，得蛋白浓度为3.5％～5％、甘氨酸含量为10～30g/L的中间品。
[0026]S8，病毒灭活和去除：将中间品溶液过滤除菌，置于24
±
2℃孵育24天，采用20nm除病毒滤膜过滤除病毒，复测调整pH4.0
±
0.2，过滤除菌，得半成品。
[0027]S9，检定及分装：取样做半成品检定，将半成品分装至中硼硅西林瓶，分装装量为5ml/瓶，即得P
‑
ATG成品。
[0028]在其中一些实施例中，健康人血浆的添加量为投浆量的1％～5％，醛化人红细胞的添加量为投浆量15％～30％，醛化人胎盘的添加量为投浆量15％～30％。
[0029]在其中一些实施例中，抗人T细胞猪免疫球蛋白制剂成品具有如下特征：蛋白质含量为35～55g/L，pH值为4.0
±
0.2，P
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ATG的纯度不低于蛋白质总量的95％，IgG单体与二聚体含量之和不低于95.0％，多聚体含量应不高于5.0％，E玫瑰花环形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂抗体吸收用醛化胎盘，其特征在于，其为采用甲醛含量0.8％～3％的醛化液醛化反应3～7h所制备的醛化人胎盘。2.权利要求1所述的杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：获取内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻；将解冻后的人胎盘渣置于胎盘醛化液中进行醛化反应3～7h，所述胎盘醛化液为含0.8％～3％甲醛的磷酸盐缓冲液；将醛化胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中洗涤，再转入中和液中进行中和反应，所述中和液为含甘氨酸的氯化钠溶液，再次洗涤，控干，即得醛化胎盘。3.根据权利要求2所述的杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法，其特征在于，所述胎盘醛化液为含1％甲醛的磷酸盐缓冲液。4.一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，获取经人外周血T淋巴细胞或者人胸腺细胞免疫的猪血浆；S2，置于37℃条件下，融浆；S3，向融浆后的猪血浆中加入健康人血浆，得料液A；S4，向料液A中加入乙醇至其终浓度为8wt％，调整pH至7.0
±
0.5，置于0～5℃环境下反应，静置并分离，沉淀为组分I废弃，得上清液B；向上清液B中加入乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0
±
0.5，置于
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5～
‑
10℃环境下反应，静置并分离，得沉淀为组分Ⅱ+Ⅱ；将组分Ⅱ+Ⅱ沉淀用注射用水溶解，加入乙醇至其终浓度为17wt％，调整pH至5.0
±
0.5，置于0～
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5℃环境下反应，静置并分离，沉淀为组分Ⅱ废弃，得上清液C；对所述上清液C超滤脱醇并浓缩，得浓缩液D；S5，向浓缩液D中加入醛化人红细胞，进一步吸收杂抗体，分离红细胞，收集上清液E；再加入醛化人胎盘，进行一步吸收杂抗体，分离胎盘，收集上清液F；超滤浓缩，得浓缩液G；S6，向浓缩液G中加入乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0
±
0.5，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，张智，邹浩勇，郭晓东，王智，吴笛，闫新业，黄梦，黄云霞，罗志，王杰，童凌峰，余健，
申请(专利权)人：武汉中生毓晋生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：