基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法及试剂盒技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，包括如下步骤：步骤一，以待测样品中EV71病毒核酸样本为模板，利用反转录等温扩增技术扩增目标片段，得到扩增产物；步骤二，向扩增产物中加入Cas12a/crRNA复合物，在crRNA介导下进行特异性切割反应；步骤三，在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA探针的缓冲液进行孵育，得到待测反应液；将待测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上，观察检测线和质控线的显色情况，判断是否含有待测病原。本发明专利技术还公开了一种71型肠道病毒的检测试剂盒。该检测方法和试剂盒可实现对71型肠道病毒的快速检测，具有特异性好、灵敏度高和检测成本低等特点。成本低等特点。成本低等特点。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于核酸检测
，特别涉及一种基于CRISPR系统进行71 型肠道病毒的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease，HFMD)是由肠道病毒引发的 常见儿童传染病，常发于五岁以下儿童，以发热、口腔溃疡、手、脚及臀部 的水疱性皮疹为主要表现，一年四季均可发病，尤以夏秋季节最为多见，是 世界范围内流行范围较广的学龄前儿童常见急性传染病，具有传播速度快， 传染率高等特点，易导致聚集性疫情出现。HFMD的传染源包括患者、病毒 携带者及隐性感染者，其中隐性感染者在疾病散发期间还是重要的传染源。 由于患者唾液、粪便及疱疹液中均含有大量病毒，可通过呼吸道、消化道及 密切接触等方式迅速传播。
[0003]HFMD由肠道病毒引起；引发HFMD的肠道病毒有20多种，主要为柯 萨奇病毒(Coxasckie virus：A组4、5、7、9、10、16型，B组2、5、13型)， 埃可病毒(ECHO viruses)和肠道病毒68
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71型(EV68
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71)。其中，以EV71 及柯萨奇病毒A16型(CA16)最为常见。EV71感染与CA16感染在HFMD 流行期间交替出现，或共同存在，成为HFMD的主要病原学因素。在诊断 HFMD病例的病原学因素中，EV71占44％，CA16占25％。其中，重症病例 中EV71阳性占74％，死亡病例中EV71阳性占93％。因此，EV71是导致HFMD 重症和死亡的主要病原。
[0004]EV71感染常导致严重的神经系统症状。病毒从咽部或肠道侵入后，在局 部黏膜或淋巴组织中繁殖；病毒可引起局部症状，继而又侵入淋巴结，并由 此进入血液循环，导致病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋 巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，再次引起病毒血症。 此后，病毒随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处， 进一步繁殖并引起病变。感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。 当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经 系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性病变、血栓形成可导致 缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经 性作用外，还存在广泛的血管周围和实质性细胞炎症。
[0005]EV71感染临床表现特点多样化：从无症状的隐性感染，普通HFMD和 咽峡炎等轻症病例，到神经源性肺水肿和呼吸衰竭等重症患儿，甚至死亡。 诊断肠道病毒EV71型感染目前主要依赖病毒核酸检测和病毒分离培养，部分 基层医院和疾病预防控制中心缺乏相应条件，部分重症病例临床上并无典型 的HFMD表现。所以，在疫情暴发初期重症病例常常难以明确诊断，常被诊 断为肺炎。只有结合病例的流行病学调查、临床表现，特别是实验室检测结 果，才有可能进行明确诊断。目前，检测HFMD的方法主要采用病毒分离培 养、胶体金试纸条、病毒中和试验、RT
‑
PCR和ELISA法等。其中，EV71分 离培养周期长、价格昂贵、灵敏度低、对设备要求高。胶体金试纸条法虽然 简单快捷，但灵敏度稍低。RT
‑
PCR灵敏度和特异性均较高，且采样方便、检 测时间较短，可作为EV71早期感染的诊断。但此方法对实验环境
和操作人员 要求高，不利于基层医院开展。ELISA是目前主要的检测方法，经济、方便。 特别适用于基层对HFMD中EV71型和CA16型防控第一线需求。但感染初 期产生抗体IgM存在个体差异。
[0006]CRISPR/Cas12a系统是一种新型的CRISPR/Cas系统，具有RNA引导的 DNA酶切割活性，在特异性切割双链DNA(dsDNA：EV71
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VP1)的同时能够 激活Cas12a的非特异性单链DNA(ssDNA)剪切活性。利用这一特点可针对 目标DNA人为设计crRNA(CRISPR
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derived RNA)与目标DNA中PAM (protospacer
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adjacent motif)区附近DNA互补，实现对不同靶标DNA的直 接检测。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR系统进 行71型肠道病毒的检测方法及试剂盒，该检测方法和试剂盒具有明显的靶标 普适性，可实现对71型肠道病毒的快速检测，具有特异性好、灵敏度高和检 测成本低等特点。
[0008]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实 现：
[0009]一种非疾病的诊断目的的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方 法，包括如下步骤：
[0010]步骤一，以待测样品中EV71病毒核酸样本为模板，利用反转录等温扩增 技术并采用特异性引物扩增目标片段，得到扩增产物；
[0011]步骤二，向步骤一所得的扩增产物中加入Cas12a/crRNA复合物，在crR NA介导下进行特异性切割反应；
[0012]步骤三，在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA探针的缓冲液进行 孵育，得到待测反应液；将待测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上，等待5
ꢀ‑
10min，观察检测线和质控线的显色情况，判断是否含有待测病原；
[0013]进一步的，EV71病毒核酸样本为：待测EV71病毒核酸的DNA全长或 片段、待测EV71病毒核酸的PCR产物或恒温扩增产物。
[0014]进一步的，所述特异性引物的核苷酸序列如Seq ID NO.2和Seq ID NO. 3所示。
[0015]进一步的，cas12a基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0016]进一步的，crRNA的序列为与待测EV71核酸特异性结合的序列；且cr RNA是针对EV71
‑
VP1的3段保守序列设计得到。
[0017]更进一步的，crRNA包含如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO. 6所示的核苷酸序列。
[0018]进一步的，所述DNA探针为FAM基团和Biotin基团双标记的单链DNA 探针；且所述DNA探针的核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
[0019]进一步的，步骤一中的扩增反应是在23℃
‑
45℃条件下进行等温扩增10
‑ꢀ
15min；步骤二的反应是在37℃条件下反应10
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20min；步骤三的孵育过程是 在37℃条件下孵育10
‑
15min。
[0020]本专利技术提供了一种单链DNA探针，其两端分别利用FAM基团和Biotin 基团进行双标记，且其核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
[0021]本专利技术进一步提供了一种71型肠道病毒的检测试剂盒，其包括crR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非疾病的诊断目的的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，以待测样品中EV71病毒核酸样本为模板，利用反转录等温扩增技术并采用特异性引物扩增目标片段，得到扩增产物；步骤二，向步骤一所得的扩增产物中加入Cas12a/crRNA复合物，在crRNA介导下进行特异性切割反应；步骤三，在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA探针的缓冲液进行孵育，得到待测反应液；将待测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上，等待5
‑
10min，观察检测线和质控线的显色情况，判断是否含有待测病原。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，EV71病毒核酸样本为：待测EV71病毒核酸的DNA全长或片段、待测EV71病毒核酸的PCR产物或恒温扩增产物。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如Seq ID NO.2和Seq ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，crRNA的序列为与待测EV71核酸特异性结合的序列；且crRNA是针对EV71
‑
VP1的3段保守序列设计得到。5.根据权利要求4所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，crRNA包含如Seq ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫小兵，杜金格，毕明芳，朱刚，吴薛琴，
申请(专利权)人：斯慧生物科技吉林有限公司，
类型：发明
国别省市：