一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法技术

本申请涉及免疫学技术领域，具体公开了一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：（1）制备免疫抗原SARA

【技术实现步骤摘要】
一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法


[0002]本申请涉及免疫学
，更具体地说，它涉及一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法。

技术介绍

[0003]沙拉沙星为动物专用第三代氟喹诺酮类广谱抗菌药物，该品的抗菌活性强于双氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星
‑
丁胺卡那霉素及妥布霉素等，对厌氧菌的抗菌活性与环丙沙星相当，具有很强的杀菌力，其杀菌作用不受细菌生长期的影响，同时还具有极广的抗菌谱，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及支原体均具较好抗菌活性。
[0004]现有技术中为得到抗沙拉沙星单克隆抗体，采用碳二亚胺法合成SARA人工抗原，通过免疫BALB/c小鼠，选择血清效价高且敏感性好的小鼠，采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合，筛选分泌抗SARA单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用体内诱生腹水法制备SARA mAb，通过间接ELISA和间接竞争ELISA对SARA mAb的免疫学特征进行鉴定。其中在进行细胞融合的过程中多选用化学融合剂聚乙二醇(PEG)。
[0005]针对上述中的相关技术，细胞融合效果与PEG的分子量和浓度有关，分子量和浓度越大，起到的细胞融合效果越优异，但过程中对细胞的毒性也就越大，导致SARA mAb的效价、敏感性、亲和力以及特异性不佳，整体品质有损失，因此，需要提出一种新的方案来解决上述问题。

技术实现思路

[0006]为了减少PEG在细胞融合过程中的不利影响，并提高得到SARA mAb的整体品质，本申请提供一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法。
[0007]本申请提供的一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法，采用如下的技术方案：一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法，包括包括以下步骤：(1)制备免疫抗原SARA
‑
BSA和包被抗原SARA
‑
OVA：称取2.5mgSARA溶解于1mlDMF中，加入5mgN
‑
羟基琥珀酰亚胺和10mg碳二亚胺，室温避光搅拌4h，得到活化后的SARA溶液；称取10mgBSA溶于2mlPBS缓冲液中，将活化后的SARA溶液逐滴加入到BSA溶液中，室温避光搅拌6h；将得到的产物在4℃的PBS缓冲液中透析72h，每8h更换透析液一次，然后将得到的透析液5000rpm下离心6min，上清液即为疫抗原SARA
‑
BSA；并同法制得包被抗原SARA
‑
OVA；(2)动物免疫：以20ug/只的剂量背部皮下多点注射免疫SPF级BALB/c小鼠，免疫4次，每次免疫间隔时间为3周，第4次免疫30天后对小鼠进行断尾采血，测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；(3)杂交瘤细胞株的建立：NSO骨髓瘤细胞与BALB/c小鼠脾细胞在融合剂的作用下融合，将细胞悬液置于RPMI
‑
1640培养基的恒温培养箱中进行培养，7天后用HT培养基置换半量细胞液，15天后抽取细胞上清液，间接ELISA法测定并选取阳性高的孔，通过有限稀释
法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗沙拉沙星代谢物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)单克隆抗体的大量制备：选用8周龄BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml腹水刺激剂，10天后将亚克隆后扩大的细胞注入小鼠腹腔，5天后抽取采集腹水，并通过辛酸
‑
硫酸铵沉淀纯化腹水，分装，
‑
20℃保存，获得SARA mAb；上述步骤中，所述融合剂主要包括聚乙二醇、溶血卵磷脂和植物血凝素，且聚乙二醇、溶血卵磷脂和植物血凝素的质量混合比为1：(0.3
‑
0.6)：(0.1
‑
0.3)。
[0008]通过采用上述技术方案，聚乙二醇可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。溶血卵磷脂分子的结构有利于其深入细胞膜，能改善细胞的通透性，使受损的细胞更替加快，并对层粘连蛋白的生成有促进作用，有利于细胞的代谢、存活、迁移、增殖和分化。植物血凝素有助于促进某些细胞因子的产生和膜表面蛋白的表达，具有促进有丝分裂和诱导干扰素分泌的活性。本申请发现，将聚乙二醇、溶血卵磷脂和植物血凝素按一定比例范围混合作为融合剂使用时，不仅能够起到优异的细胞融合效果，还能够降低对细胞的毒性作用，有利于得到效价高、敏感性好、亲和力以及特异性优异的SARA mAb。
[0009]优选的，所述步骤(3)中，融合剂的pH值为8.0
‑
8.2。
[0010]通过采用上述技术方案，选择上述pH值的融合剂，能够发挥出良好稳定的细胞融合效果。
[0011]优选的，所述步骤(3)中，融合剂的滴加操作为，先在10
‑
15s加入0.3ml融合剂，然后28
‑
32s加入0.4ml融合剂，最后10
‑
15s加入0.3ml融合剂。
[0012]通过采用上述技术方案，融合剂选用上述滴加方式，并控制滴加速度，能够发挥出优异的细胞融合效果。
[0013]优选的，所述步骤(3)中，在加入融合剂反应1.5
‑
2.5min后，加入10
‑
15ml的GNK溶液进行终止反应。
[0014]通过采用上述技术方案，在加入融合剂反应一段时间后，加入GNK溶液进行终止反应，使细胞融合效果最佳。
[0015]优选的，所述GNK溶液在加入前进行预热，预热温度为37
‑
40℃。
[0016]通过采用上述技术方案，对GNK溶液进行预热，并预热至37
‑
40℃，不易对细胞造成损伤，且起到稳定的终止效果。
[0017]优选的，所述GNK溶液的滴加操作为，先在25
‑
35s加入1mlGNK溶液，然后30
‑
35s加入3mlGNK溶液，最后25
‑
30s加入剩余的GNK溶液。
[0018]通过采用上述技术方案，GNK溶液选用上述滴加方式，并控制滴加速度，能够发挥出优异的细胞融合效果。
[0019]优选的，所述步骤(4)中，腹水刺激剂可以选用为无菌液体石蜡、降植烷和弗氏不完全佐剂中的任意一种。
[0020]通过采用上述技术方案，上述种类的腹水刺激剂能有效抑制小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的免疫功能，使小鼠能更好的接纳腹腔中具有恶性生长特性的杂交瘤，进而在后续收集腹水时，能够获得较好的效果。
[0021]优选的，所述步骤(4)中，注入单只小鼠腹腔的细胞个数为2
×
106‑5×
106个。
[0022]通过采用上述技术方案，上述注射量的亚克隆后扩大的细胞，能够在小鼠腹腔内形成数量稳定和品质优异的SARA mAb。
[0023]优选的，所述聚乙二醇、溶血卵磷脂和植物血凝素的质量混合比为1：0.5：0.3。
[0024]通过采用上述技术方案，上述比例混合的聚乙二醇、溶血卵磷脂和植物血凝素，在应用过程中起到的细胞融合效果最优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗沙拉沙星代谢物单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备免疫抗原SARA
‑
BSA和包被抗原SARA
‑
OVA：称取2.5mgSARA溶解于1mlDMF中，加入5mgN
‑
羟基琥珀酰亚胺和10mg碳二亚胺，室温避光搅拌4h，得到活化后的SARA溶液；称取10mgBSA溶于2mlPBS缓冲液中，将活化后的SARA溶液逐滴加入到BSA溶液中，室温避光搅拌6h；将得到的产物在4℃的PBS缓冲液中透析72h，每8h更换透析液一次，然后将得到的透析液5000rpm下离心6min，上清液即为疫抗原SARA
‑
BSA；并同法制得包被抗原SARA
‑
OVA；（2）动物免疫：以20ug/只的剂量背部皮下多点注射免疫SPF级BALB/c小鼠，免疫4次，每次免疫间隔时间为3周，第4次免疫30天后对小鼠进行断尾采血，测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；（3）杂交瘤细胞株的建立：NSO骨髓瘤细胞与BALB/c小鼠脾细胞在融合剂的作用下融合，将细胞悬液置于RPMI
‑
1640培养基的恒温培养箱中进行培养，7天后用HT培养基置换半量细胞液，15天后抽取细胞上清液，间接 ELISA法测定并选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗沙拉沙星代谢物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；（4）单克隆抗体的大量制备：选用8周龄BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml腹水刺激剂，10天后将亚克隆后扩大的细胞注入小鼠腹腔，5天后抽取采集腹水，并通过辛酸
‑
硫酸铵沉淀纯化腹水，分装，
‑
20℃保存，获得SARA mAb；上述步骤中，所述融合剂主要包括聚乙二醇、溶血卵磷脂和植物血凝素，且聚乙二醇、溶血卵磷脂和植物血凝素的质量混合比为1：（0.3
‑
0.6）：（0.1
‑
0.3）。2.根据权利要求1所述的抗沙拉沙...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚林，杨晟，包玉玺，
申请(专利权)人：上海轻工业研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：