用于检测芘和苯并[a]芘的单抗及酶联免疫方法与试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种能识别芘和苯并[a]芘的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C2022148的杂交瘤细胞株PYR/4D6所分泌的。本发明专利技术还公开了所述抗体在制备检测芘和苯并[a]芘的试剂盒中的应用以及一种检测水产品中芘和苯并[a]芘残留的酶联免疫方法。本发明专利技术制备的单抗具有特异性好、灵敏度高的优点，适用于鱼、虾、蟹等水产品中芘和苯并[a]芘的痕量残留检测。检测。检测。

【技术实现步骤摘要】
用于检测芘和苯并[a]芘的单抗及酶联免疫方法与试剂盒


[0001]本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种抗芘和苯并[a]芘的单克隆抗体，本专利技术还涉及该单抗的应用以及一种检测水产品中芘和苯并[a]芘的酶联免疫方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是由两个或两个以上苯环组成的一大类烃类有机化合物的统称，是环境介质中分布最广泛的持久性有机污染物之一。由于它们具有π
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π键的共轭系统，性质比较稳定。PAHs因其显著的健康风险和对人类和动物的不利影响而受到广泛关注。PAHs具有疏水亲脂特性，易与矿物质、有机质结合，吸附在悬浮物和沉积物中，也易在生物体脂类中富集，破坏水生生态系统。PAHs具致畸性、致癌性、致突变性、遗传毒性和神经毒性，是目前人类接触最多的污染物。长期接触PAHs可导致肺癌、皮肤癌、胃癌等患癌风险的增加。也可造成孕妇较高流产率，并且可通过母体对婴儿的生长产生严重的影响，导致幼儿患病风险增加。鉴于其巨大的危害性，欧盟食品科学委员会与美国环保局(USEPA)将萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1，2，3
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cd)芘、二苯并(a，h)蒽和苯并(g，h，i)苝这16种PAHs列为优先控制污染物。水体环境中的PAHs可通过水体、食物、沉积物等途径进入鱼、虾、蟹等水生生物体内。
[0003]目前对于PAHs的仪器检测法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、质谱联用法和荧光检测法等仪器方法。虽然这些方法灵敏度较高，但是样品的前处理较麻烦，依赖昂贵的仪器设备和专门的操作人员，不能实现大批量样本的现场检测。而用于多环芳烃类化合物的免疫学方法具有简单快速、高灵敏度和选择性等优点，非常适合大批量样品的现场检查，主要包括酶联免疫法(ELISA)、电化学免疫检测(ECIA)、金标免疫层析法(GICA)等其他免疫分析方法。其中酶联免疫检测方法(ELISA)具有高灵敏、简单、快速、高效等优点，非常适合复杂基质中痕量组分的分析。
[0004]CN 103965349A公开了一种多环芳烃完全抗原，多环芳烃单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。以芘丁酸为半抗原，制备的单抗能同时识别7种多环芳烃(菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并芘)，特异性较差；而且对芘的IC
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为0.9μg/mL，最低检测限LOD为0.05μg/mL，灵敏度较低，不能满足水产品鱼虾蟹中多环芳烃类的痕量残留检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有抗体特异性、灵敏度低的缺陷，提供能同时识别芘和苯并[a]芘的单克隆抗体及其应用。
[0006]上述目的是通过以下方案实现的：
[0007]用于制备单克隆抗体的半抗原γ
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氧代
‑1‑
芘丁酸(简称OPBA)，其结构式如下：
[0008][0009]将所述半抗原与载体蛋白偶联合，合成免疫原和包被原。
[0010]用免疫原免疫小鼠，对小鼠脾脏进行细胞融合，然后经过亚克隆得到杂交瘤细胞株PYR/4D6，再采用体内诱生腹水法获得单克隆抗体。
[0011]所述的杂交瘤细胞株PYR/4D6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC.NO:C2022148。
[0012]所述的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)。
[0013]本专利技术所制备的单克隆抗体能特异性识别芘(PYR)和苯并[a]芘(BaP)，它由杂交瘤细胞株PYR/4D6所分泌。
[0014]所述的单克隆抗体用于制备检测芘和苯并[a]芘的试剂盒。
[0015]所述的试剂盒是检测芘和苯并[a]芘的酶联免疫试剂盒。
[0016]所述的试剂盒在芘和苯并[a]芘非诊断目的检测中的应用，用于检测水产动物类食品如鱼、虾、蟹中的芘和苯并[a]芘，防止这类食品对人体产生危害。
[0017]本专利技术进一步提供一种检测水产品中芘和苯并[a]芘残留的酶联免疫方法，包括以下步骤：
[0018](1)将半抗原γ
‑
氧代
‑1‑
芘丁酸与卵清蛋白偶联得到包被原；
[0019](2)利用保藏号为CCTCC NO:C2022148的杂交瘤细胞PYR/4D6制备单克隆抗体并稀释；
[0020](3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；
[0021](4)将待测样品的组织匀浆，然后用乙酸乙酯震荡提取，将有机相氮气吹干后用正己烷溶解，最后加入DMF震荡，离心取下层液作为待测液；
[0022](5)对步骤(4)的待测液进行酶联免疫检测。
[0023]本专利技术的有益效果是：
[0024](1)特异性。本专利技术制备的单抗仅能识别芘和苯并[a]芘2种多环芳烃类化合物，而与其他多环芳烃类化合物如菲、蒽、荧蒽、苯并蒽、屈等因无交叉反应而不能识别(参见表4)。因此，本专利技术能从众多的多环芳烃类化合物中特异性检测出芘和苯并[a]芘。
[0025](2)灵敏度。本专利技术制备的单抗对芘和苯并[a]芘的IC
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值分别为3.37μg/L和8.89μg/L，对芘的最低检测限LOD约为0.5μg/L，对苯并[a]芘的最低检测限LOD约为0.9μg/L(参见表5)。本专利技术的检测灵敏度远高于现有的检测芘或苯并[a]芘的同类抗体，因此适用于鱼、虾、蟹等水产品中芘和苯并[a]芘的痕量残留检测。
[0026](3)本专利技术提供的检测方法还具有精密度高、重现性好，简单省时，样品处理使用的有机试剂少，对人体危害小，对操作者要求较低等优点。
附图说明
[0027]图1为本专利技术的单克隆抗体与芘标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为芘标准
溶液浓度的对数值，Y轴为芘标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。
具体实施方式
[0028]下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。
[0029]实施例1免疫原和包被原的制备
[0030]1.1免疫原(OPBA
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BSA)的制备
[0031]称取45mg OPBA溶解于3mL DMF中，加入20mg NHS和55mg EDC，室温搅拌8h后过滤膜。称取63mg BSA溶解于9mL PBS(pH＝7.4)中；配成浓度为7mg/mL BSA溶液。取3mL BSA溶液，缓慢加入200μL OPBA溶液，边加边搅拌，室温下搅拌过夜，然后装入透析袋4℃PBS透析3
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5d，一天换三次透析液，10000r/min离心10min，弃去沉淀，取上清，保存到
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20℃冰箱中备用。
[0032]1.2包被原(OPBA
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OVA)的制备
[0033]称取45mg OVA溶于9mL CBS(pH＝9.6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能识别芘和苯并[a]芘的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C2022148的杂交瘤细胞株PYR/4D6所分泌的。2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株PYR/4D6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022148。3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测芘和苯并[a]芘的试剂盒中的应用。4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。5.如权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测芘和苯并[a]芘的酶联免疫试剂盒。6.一种检测水产品中芘和苯并[a]芘残留的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将半抗原γ
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【专利技术属性】
技术研发人员：彭大鹏，吴双敏，李华明，殷晓阳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：