特异性结合红霉素的新型单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合红霉素的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区，包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1；SEQ ID NO:2所示的重链CDR2；和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；所述轻链可变区，包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1；SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。本发明专利技术提供一种对红霉素具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。试验证明：本发明专利技术的红霉素单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。胶体金免疫检测的原料。胶体金免疫检测的原料。

【技术实现步骤摘要】
特异性结合红霉素的新型单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种特异性结合红霉素的新型单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]红霉素（Erythromycin，又叫红霉素碱、红丝霉素、阿达霉素，CAS号：114
‑
07
‑
8），分子式为C
37
H
67
NO
13
，属于大环内酯类抗生素。红霉素在临床主要应用于链球菌引起的扁桃体炎、猩红热、白喉及淋病、李斯特菌病、肺炎链球菌下呼吸道感染。红霉素是我国一种常用的兽药，在畜禽上主要用于抗细菌及支原体的感染，其在动物体内代谢时间较长，过量使用会导致动物体内的药物残留。人在使用红霉素后，能引起胃肠道反应和过敏反应，严重将引起肝脏损伤，对人类的健康造成严重威胁。
[0003]目前世界各国规定大环内酯类抗生素在动物性食品中的允许残留最大值为40
‑
1500 μg/kg。我国《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》 GB31650
‑
2019规定了红霉素A在鸡和火鸡的肌肉、脂肪、肝、肾的最大残留量为100 μg/kg，在鸡蛋的最大残留量为50 μg/kg，在动物源性奶的最大残留量为40 μg/kg。
[0004]目前红霉素检测多采用高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱与质谱联用法（LCMS）、气质联用法（GC
‑
MS）等。仪器法进行定量分析具有较低的检测限，但是仪器操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。免疫分析方法具有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。

技术实现思路

[0005]为此，本专利技术提供特异性结合红霉素的新型单克隆抗体及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术实施例提供特异性结合红霉素的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区，包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1；SEQ ID NO:2所示的重链CDR2；和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；所述轻链可变区，包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1；SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
[0007]本专利技术的另一方面还提供编码所述的单克隆抗体的基因。
[0008]包含上述所述编码所述单克隆抗体的基因的表达载体，也属于本专利技术的保护范围。
[0009]本专利技术又一方面还提供包含上述所述表达载体的转化体。
[0010]本专利技术还提供一种红霉素检测试剂盒，其包含上述所述的单克隆抗体。
[0011]本专利技术的一个实施例中，所述试剂盒为胶体金检测试剂盒，所述胶体金检测试剂盒的结合物释放垫上喷涂有胶体金标记所述的单克隆抗体。
[0012]本专利技术具有如下优点：本专利技术提供一种对红霉素具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体，为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
[0013]试验证明：本专利技术的红霉素单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0015]本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。
[0016]图1为本专利技术实施例提供的红霉素单克隆抗体轻链基因序列同源性比对图；图2为本专利技术实施例提供的红霉素单克隆抗体重链基因序列同源性比对图；图3为本专利技术实施例提供的红霉素单克隆抗体轻链氨基酸序列同源性比对图；图4为本专利技术实施例提供的红霉素单克隆抗体重链氨基酸序列同源性比对图；图5为本专利技术实施例提供的采用间接竞争ELISA方法检测红霉素单克隆抗体灵敏度和特异性的RIDA SOFT四参数法R2曲线图；图6为本专利技术实施例提供的采用间接竞争ELISA方法检测红霉素单克隆抗体灵敏度和特异性的RIDA SOFT四参数法IC
50
曲线图；图7为本专利技术实施例提供的检测红霉素试纸条的结构示意图；图中：100
‑
样品吸收垫；200
‑
结合物释放垫；300
‑
硝酸纤维素膜；310
‑
检测线；320
‑
质控线；400
‑
吸水垫；500
‑
底板。
具体实施方式
[0017]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]实施例1本实施例提供一种红霉素单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：1、初次免疫将红霉素人工抗原（红霉素人工抗原购自深圳市安提生物科技有限公司）采用弗氏完全佐剂进行乳化（1:1），皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，免疫剂量为500 μg/只；从首次免疫开始，每4周加强免疫一次，共加强免疫2次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫；第2次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达
到1:10000以上时，进行1次冲击免疫，即腹腔注射免疫原溶液0.5mL，三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌红霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0019]2、红霉素单克隆抗体的制备细胞复苏：取出红霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.8 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞8
×
105个/只，10天后采集腹水。用辛酸
‑
饱和硫酸铵法进行纯化，得到红霉素单克隆抗体。
[0020]实施例21、红霉素单克隆抗体的灵敏度和特异性的检测，采用间接竞争Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性，结果见下表1所示。以红霉素各浓度(0，0.15，0.45，1.35，4.05，12.15 ng/ml)横坐标，以红霉素各浓度对应的OD值为纵坐标，使用RIDA 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性结合红霉素的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区，包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1；SEQ ID NO:2所示的重链CDR2；和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；所述轻链可变区，包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1；SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2；和SEQ ID NO:6所示的轻链...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴迪，魏单平，赵荣茂，王继圣，李亚洲，刘芳玉，冯海玲，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：