抗河豚毒素抗体Y126C、制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，提供了一种针对河豚毒素的人源化抗体Y126C及应用，该人源化抗体重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
抗河豚毒素抗体Y126C、制备方法及用途


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种用于抗河豚毒中毒的人源化抗体Y126C、其制备方法及在制备河豚毒素制剂方面的用途。

技术介绍

[0002]河豚的鱼肉鮮嫩味美，帶有肉刺的鱼皮,胶质浓厚，食之黏口，味觉美感远胜于鱼翅、海参，因此被誉为“长江三鲜”之首。但河豚大都含有河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)，毒素集中于卵巢、肝脏、肾脏、血液、眼睛、鱼鳃及皮肤中。河豚毒素比较稳定，用盐腌、日晒、一般加热烧煮等方法都不易消除。河豚毒素的化学研究始于1909年，1964年以后由Woodward测定了TTX的结构，1972年Kishi等采用化学方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子式为C11H17N3O8，分子量为319.27。分子主要由3个氮原子组成，它们与氢氧原子形成特殊的结构。其结构特征含有1个碳环，1个胍基，6个羟基，在C—5和C—10位有一个半醛糖内酯连接着分开的环。有专家将其称为“自然界最奇特的分子之一”，也是世界上最致命的毒药之一。1g河豚毒素的毒性是1g氰化物的1万倍。
[0003]由于抗体能够高效、特异地与体内和体外的各种抗原蛋白结合，使得抗体不仅能应用于调节免疫系统功能，还可以应用于各种高灵敏的检测方法。目前，抗体药物是生物技术药物最重要的组成部分，抗体试剂也是医学诊断和生物学研究中最常用到的试剂之一。因此，抗体相关的生物产品具有极高的应用前景和商业价值。抗体可以通过多种途径获得，对于毒素蛋白而言，抗体具有高度的中和性，是一种潜在的抗毒药物。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于，依托上述研究背景，研究抗河豚毒素人源化抗体Y126C、制备方法和用途，即提供了一种全新的人源化抗体、其制备方法和用途。
[0005]本专利技术的第一方面，提供了抗河豚毒素人源化抗体Y126C，该人源化抗体重链可变区由FRH1
‑
CDRH1
‑
FRH2
‑
CDRH2
‑
FRH3
‑
CDRH3
‑
FRH4区组成，轻链可变区由FRL1
‑
CDRL1
‑
FRL2
‑
CDRL2
‑
FRL3
‑
CDRL3
‑
FRL4区组成。
[0006]该抗体重链可变区和轻链可变区，具有SEQ ID NO.1
‑
2所示的氨基酸序列所示。
[0007]人源化抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
[0008]EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGMMAHWAAAMHWVRQAPGKGLEWVSAMAKQYRNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLLKHQMLDYWGQGTLVTVSS
[0009]人源化抗体轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：
[0010]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAVLFMVIYYATWYQQKPGQAPILVIYGYQQVMQGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCIVKMFEMFGQGTKVEIK
[0011]关于人源化抗体的获得，先构建人源化抗体噬菌体展示文库，然后对人源化抗体进行筛选，并采用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆，经序列分析后得到人源化抗体。将人源化抗体在293系统中的表达及纯化后，获得高纯度的人源化抗体。
[0012]本专利技术的第二方面，提供了所述人源化抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0013](A)根据抗体可变区基因全基因合成人源化抗体全长；
[0014](B)采用PCR技术对步骤(A)中获得的全长人源化抗体克隆到表达载体，测序验证后确认获得正确的克隆；
[0015](C)将上述表达载体引入宿主细胞内进行融合蛋白的表达。
[0016]本专利技术中，任何合适的载体都适用，优选为pGEM
‑
T、Pet32a，pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4、pDHFR或pDR1，所述表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
[0017]本专利技术中，哺乳动物或昆虫宿主细胞或原核细胞培养系统均可用于本专利技术的融合蛋白的表达。可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a、Top10、BL21(DE3)、TG1之一。
[0018]本专利技术的融合蛋白可在以下细胞中容易地产生：哺乳动物细胞，诸如CHO、NSO、HEK293、BHK或者COS细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽自杆菌或荧光假单胞菌；昆虫细胞，或真菌或酵母细胞，所述细胞使用本领域中己知的技术培养。
[0019]本专利技术中公开的融合蛋白的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达、分离、纯化所述融合蛋白。利用上述方法，可以将抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS
‑
PAGE电泳上为单一条带。
[0020]可以利用亲和层析的方法对本专利技术公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
[0021]可采用各种蛋白纯化方法，并且此类方法是本领域中己知的并且描述于例如(Wilchek and Bayer,1990,Methods in enzymology)(Scopes,2013,Protein purification:principles and practice)。
[0022]通过Biacore分析，本专利技术的人源化抗体具有良好的亲和力，通过小动物实验证明，预先注射本专利技术人源化抗体的保护组小鼠在注射河豚毒素后，无任何小鼠出现神经中毒症状，连续观察一个月无毒素致死情况。说明本专利技术的人源化抗体具有优良的抗河豚毒素的作用。
[0023]因此，本专利技术的第三方面，提供了一种含有所述人源化抗体的药物组合物。该药物组合物除了包括所述人源化抗体，还包括药学上可接受的药物载体。
[0024]本专利技术的所述人源化抗体和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本专利技术公开的所述人源化抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
[0025]通常情况下，液体制剂可以在2℃
‑
8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。
[0026]对于本专利技术公开的上述所述人源化抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中，表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗河豚毒素抗体Y126C，其特征在于，其人源化抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人源化抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的抗河豚毒素抗体Y126C，其特征在于，该人源化抗体重链可变区由FRH1
‑
CDRH1
‑
FRH2
‑
CDRH2
‑
FRH3
‑
CDRH3
‑
FRH4区组成；轻链可变区由FRL1
‑
CDRL1
‑
FRL2
‑
CDRL2
‑
FRL3
‑
CDRL3
‑
FRL4区组成。3.编码权利要求1所述的抗河豚毒素抗体Y126C的核苷酸。4.权利要求1所述的抗河豚毒素抗体Y126C的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(A)根据抗体可变区基因全基因合成人源化抗体全长；(B)采用PCR技术...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷长海，胡适，傅文燕，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：