一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法及应用技术方案

本发明专利技术公开了一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法，包括以下步骤：冰冻切片的制备：取出脑组织置于小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮，10

【技术实现步骤摘要】
一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法及应用


[0001]本专利技术涉及自身免疫性疾病诊断
，具体涉及一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法及应用。

技术介绍

[0002]自身免疫性脑炎泛指一类由免疫系统针对中枢神经系统抗原产生反应而导致的疾病，并且其逐渐被认为是非感染因素所致可逆转性脑炎的重要原因，主要表现为精神行为异常、认知功能障碍、近事记忆力下降、癫痫发作、语言功能障碍、运动障碍、不自主运动、自主神经功能障碍以及不同程度的意识障碍等。早期治疗干预可明显改善患者的转归，但由于其病因复杂，症状特异性不高，在诊断上存在较多的困难。AE相关抗体包括抗细胞内抗原和抗细胞表面抗原两类，对诊断AE有很高的特异性；部分抗体对体内潜在肿瘤的发生有很强的提示作用，并且可帮助判断治疗和预后。因此，AE相关抗体的实验室检查对AE的诊治具有重要的作用。
[0003]随着对AE诊断和治疗认识上的不断加深以及对规范化诊治的迫切需求，2016年国外神经专科专家联合在 Lancet Neuroloy上发表了关于AE的临床诊断标准，随后我国中华医学会神经学分会发布了《中国自身免疫性脑炎诊治专家共识》。《标准》和《共识》都肯定了AE相关自身抗体对AE具有确诊意义，AE相关自身抗体具有重要的临床价值。对AE相关抗体进行分类有助于了解AE对发病机制、为治疗和预后的判断提供参考。
[0004]AE一般的实验室检查包括脑脊液和血常规、生化及免疫学检查。目前AE抗体的检测最常见且公认的方法是免疫印迹法和间接免疫荧光法（Indirect immuno
‑
fluorescence assay，IFA），这些方法根据作用的底物不同又分为基于细胞底物的实验（cell
‑
based assay，CBA）和基于组织底物的实验（tissue
‑
based assay，TBA）。神经细胞表面抗体只在天然构象下才能识别其抗原表位，对于它们的检测主要用IFA。而神经细胞内抗原抗体因其抗原表位为线性，因此可用多种方法进行检查，目前常用免疫印迹法。其中TBA常用于筛查抗体，因为该法原理是将动物脑组织切片与患者血清或脑脊液一起处理后加入荧光标记的二抗，与神经细胞结合的抗体最终均会发出荧光。该法阳性结果只能说明存在抗神经细胞抗体，但不能明确具体类型，同时可用于发现新型未知AE抗体。当TBA法阳性时，需进行下一部确认实验。
[0005]基于此，本专利技术提供一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法及应用。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]本专利技术解决技术问题采用如下技术方案：本专利技术提供了一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法，包括以下步骤：步骤一，冰冻切片的制备：取出脑组织置于小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮
的小杯内，让盒底部接触液氮，10
‑
20秒组织即迅速冰冻成块；取出组织置于切片机冰冻切片，厚度为 5～6m，置于载玻片上，裱片后，立即用电吹风吹干，储存于低温冰箱内保存；步骤二，固定：取出包被脑组织的载波片，室温放置5min，用4%的多聚甲醛PBS融液室温固定15min，PBS冲洗三次；步骤三，封闭：将组织置于1%BSA的PBST融液中30min，封闭非特异性粘合的抗体；步骤四，清洗缓冲液的准备：用蒸馏水 1:10 稀释清洗缓冲液；步骤五，样本的稀释：用1x样本缓冲液稀释，用蒸馏水1:10稀释浓缩缓冲液；步骤六，封片：沿载片中线位置加入50
µ
L封片液，小心盖上盖玻片，注意避免产生气泡；步骤七，判读：在荧光显微镜的400
‑
800x总放大倍数下立即判读结果。
[0008]优选地，所述脑组织为啮齿动物或灵长类动物的脑组织。
[0009]优选地，所述清洗缓冲液包含以下重量份原料：牛血清蛋白5
‑
10份，磷酸盐缓冲液1
‑
3份，叠氮钠0.3
‑
0.7份。
[0010]优选地，所述步骤四、五中间还采用孵育、清洗处理，具体的操作步骤为：S01：孵育托盘的准备：在孵育托盘中加入去离子水或蒸馏水，并将反应载片放置于支撑板上；S02：第一次孵育处理，具体的步骤为：吸取 100
µ
L稀释好的样本到对应反应区中，吸头不可接触载片表面，确保样本完全覆盖相应反应区。
[0011]S03：清洗：孵育后移出反应载片并用吸管吸取清洗缓冲液温和冲洗，在染色皿中用清洗缓冲液浸泡反应载片10min；从染色皿取出反应载片，小心去除载片反应区外残留的清洗缓冲液；S04：第二次孵育：载片清洗完成后及时放置于孵育托盘，二次孵育处理；S05：清洗：孵育后从孵育托盘上移出反应载片并用挤压洗瓶吸取清洗缓冲液简单冲洗，在染色皿中用清洗缓冲液浸泡反应载片10min。
[0012]优选地，所述S01中第二次孵育中按实验要求向反应区加入60
µ
L的FITC荧光二抗，确保反应区被完全覆盖。
[0013]优选地，所述第二次孵育中室温下避光孵育30min。
[0014]优选地，所述步骤四中用1x样本缓冲液稀释；包括牛血清蛋白、磷酸盐缓冲液、叠氮钠样本按照重量比1:3:0.2配制而成，推荐稀释比例：血清1:50；脑脊液1:1。
[0015]本专利技术还提供了一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法在自身免疫性神经系统疾病上的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术中TBA法保留了原基质的完整抗原谱，因而可同时检测大量抗体，获得较高的检测效率。当抗几种不同抗原的抗体需要在一种生物基质上同时检测时(如抗细胞核抗原抗体)，或为每一种实验逐一准备抗原很困难或相当复杂时，就应该选择该方法；另外，应用TBA法还可检测到一些至今未知的抗体；基质中抗原谱完整，可检测多种抗体，并且检出率高；可在一种生物基质上同时检测多种抗不同生化特性抗原的抗体；此外，除使用不同部位脑组织联合检测，还可通过使用其他部位组织（如小肠、胰腺等），帮助鉴别非器官特异性抗体（如抗核抗体等），同时更好地鉴别特异性荧光模式（部分抗体在脑组织中的荧光模式
类似，但在其他组织中存在显著差异，如Hu和Ri）。同时由于TBA可提供全抗原谱，通过特异性荧光模式为发现未知的神经特异性抗体提供有力的工具。
附图说明
[0017]图1为本专利技术的流程工作示意图。
具体实施方式
[0018]下面结合具体实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]本实施例的一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法，包括以下步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，冰冻切片的制备：取出脑组织置于小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮，10
‑
20秒组织即迅速冰冻成块；取出组织置于切片机冰冻切片，厚度为 5～6m，置于载玻片上，裱片后，立即用电吹风吹干，储存于低温冰箱内保存；步骤二，固定：取出包被脑组织的载波片，室温放置5min，用4%的多聚甲醛PBS融液室温固定15min，PBS冲洗三次；步骤三，封闭：将组织置于1%BSA的PBST融液中30min，封闭非特异性粘合的抗体；步骤四，清洗缓冲液的准备：用蒸馏水 1:10 稀释清洗缓冲液；步骤五，样本的稀释：用1x样本缓冲液稀释，用蒸馏水1:10稀释浓缩缓冲液；步骤六，封片：沿载片中线位置加入50
µ
L封片液，小心盖上盖玻片，注意避免产生气泡；步骤七，判读：在荧光显微镜的400
‑
800x总放大倍数下立即判读结果。2.根据权利要求1所述的一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法，其特征在于，所述脑组织为啮齿动物或灵长类动物的脑组织。3.根据权利要求1所述的一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法，其特征在于，所述清洗缓冲液包含以下重量份原料：牛血清蛋白5
‑
10份，磷酸盐缓冲液1
‑
3份，叠氮钠0.3
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0.7份。4.根据权利要求1所述的一种提高自身免疫性神经系统疾病诊断率的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：麦景文，
申请(专利权)人：阿维森纳广州健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：