一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。该多肽的氨基酸序列为HNWMWYASLPDR。本发明专利技术针对现有手足口病诊疗药物特异性不强的问题，以人肠道病毒71型重要衣壳蛋白VP1为靶分子，通过对噬菌体展示随机12肽库进行生物淘洗，获得了一种多肽，通过噬菌体ELISA实验表明，该多肽可以特异性识别和结合EV71病毒VP1蛋白，且分子量小，易于化学合成，免疫原性低。该多肽的成功制备在手足口病诊断、治疗、预防等产品的研发领域具有良好的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及这一种一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]人肠道病毒71型(EV71)是单股正链RNA病毒，从属于小RNA病毒科肠道病毒A属。它是引发手足口病(Hand
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foot
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and
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mouth disease,HFMD)的主要病原体之一，发病时主要表现为发热、腹泻及疱疹性咽峡炎。与典型手足口病不同的是，某些EV71毒株感染可引起重症手足口病，并导致严重的神经系统并发症如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹和神经源性肺水肿等，具有较高的病死率和致残率。EV71发病广泛，已成为全球关注的公共卫生问题。
[0003]EV71病毒有A、B、C三种基因型，其基因组全长约含有7500个核苷酸，编码具有2193个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白可以水解为P1、P2、P3三种前体蛋白，这三种前体蛋白可被自身酶系切割为VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白以及2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D七个非结构蛋白。其中，VP4蛋白包埋于病毒外壳的内侧，其余三个结构蛋白均暴露于病毒颗粒表面，直接接触宿主免疫系统；VP1蛋白是EV71重要的衣壳蛋白之一，它决定这病毒的基因型，极易发生氨基酸序列改变，是病毒的毒力决定簇，也是导致患者出现肺水肿的直接原因。因此，VP1蛋白已成为科研工作者重点关注的对象之一。
>[0004]从手足口病在我国首次出现以来，为了防止病毒流行和降低手足口病爆发的隐患，针对EV71病毒进行的抗病毒药物和疫苗研发从未停止过。我国于2015年12月到2017年5月，先后有3种手足口病疫苗经国家食品药品监督管理总局批准上市，分别是中国医学科学院医学生物研究所的EV71人二倍体细胞疫苗、北京科兴生物制品有限公司的EV71灭活疫苗和武汉生物制品研究所的EV71灭活疫苗。疫苗的预防接种已经大幅度降低了我国手足口病爆发的几率，但是目前仍然存在一些问题需要克服：(1)疫苗接种覆盖率不足以及不是所有人都能对现有疫苗产生良好反应的事实使得研发新型诊断和治疗EV71病毒的药物十分必要，尤其是在遇到大规模感染的时候；(2)EV71病毒具有嗜神经性，目前还不清楚具体的作用机理，严重程度下造成的神经系统疾病能否避免；(3)EV71病毒能够切割参与免疫的蛋白来规避免疫反应，能否克服这一问题也是一个难点；(4)病毒具有潜伏期，大多数情况下发病时已经错过最佳治疗时期，如果能在病毒潜伏期就检测出病毒并有针对性的进行预防和治疗，不但能够降低对患者的伤害，还能降低治疗成本。
[0005]因此，制备出能够特异性识别VP1蛋白的多肽，对于EV71病毒的检测和治疗药物的研发具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术中提供了一种能够特异性识别和结合EV71病毒的VP1蛋白的多肽，该多肽
的氨基酸序列为HNWMWYASLPDR。
[0007]本专利技术中还提供了该多肽的制备方法，包括以下步骤：
[0008]S1、制备人肠道病毒71型VP1蛋白：以SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为模板，制备氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的VP1蛋白；
[0009]S2、生物淘洗：在孔板中加入VP1蛋白和GST蛋白，并接种大肠杆菌菌株和含四环素的培养基，培养；倾去残余液体，加入封闭液，用洗涤液洗涤若干次；加入噬菌体溶液扩增、纯化、洗脱得到洗脱的噬菌体；将洗脱的噬菌体溶液加入大肠杆菌培养物中扩增，分离得到扩增的洗脱液；重复进行第二轮、第三轮筛选，得到筛选出的阳性噬菌斑；
[0010]S3、扩增阳性噬菌体：：将大肠杆菌培养物稀释，蘸取若干分隔良好的蓝色噬菌斑接种培养扩增；然后离心取上清得到扩增的阳性噬菌体；
[0011]S4、编码噬菌体呈现的多肽的DNA序列测定及氨基酸序列推导和氨基酸序列同源性分析；
[0012]S5、对筛选出的阳性噬菌体进行ELISA鉴定。
[0013]在可选的实施方式中，步骤S1包括以下步骤：
[0014]S1
‑
1、合成如SEQ ID No.3所示的EV71病毒VP1蛋白的cDNA，扩增EV71病毒VP1蛋白的核苷酸序列，将扩增后的序列连接至pFastBac1载体中，得到重组载体VP1
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pFastBac1；
[0015]S1
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2、将所述重组载体VP1
‑
pFastBac1转化到大肠杆菌DH10Bac中，得到表达VP1蛋白的杆状病毒穿梭载体，选择2个穿梭载体转染Sf9细胞产生一代病毒P1；
[0016]S1
‑
3、将步骤S1
‑
2中Sf9细胞的细胞培养上清、细胞裂解上清和经过重悬的细胞裂解沉淀加入到载样缓冲液中混匀、煮沸、离心，取上清进行10％SDS
‑
PAGE凝胶电泳，制备背景清晰的干胶保存；对所述干胶进行Western Blot纯化，得到P1病毒储液；
[0017]S1
‑
4、选取感染复数为1～10的P1病毒储液感染Sf9细胞，确定最佳感染复数，选取最佳感染复数的P1病毒储液进行扩大培养得到二代病毒P2；
[0018]S1
‑
5、收集P2感染的Sf9细胞的裂解上清，用His60 Ni Superflow Resin对VP1蛋白进行纯化，用含有30mmol/L、50mmol/L、200mmol/L、300mmol/L咪唑的PBS缓冲液分阶段洗脱柱子，收集各浓度梯度洗脱下来的蛋白，对洗脱液进行SDS
‑
PAGE凝胶电泳分析；
[0019]S1
‑
6、将步骤S1
‑
5中SDS
‑
PAGE分析结束后的凝胶进行Western Blot鉴定，得到的纯化后的VP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0020]在可选的实施方式中，步骤S2包括以下步骤：
[0021]S2
‑
1、在96孔板的2个孔中分别加入200μL用0.1mol/L的NaHCO3溶液稀释的浓度为100μg/mL的VP1
‑
His溶液和GST
‑
His溶液，4℃孵育过夜；接种10mL大肠杆菌于含四环素的20mL LB培养基中，37℃培养；取出96孔板，除尽残余液体；加入200μL TBS封闭液，4℃孵育2h；然后用TBST缓冲液洗涤若干次，每次洗涤均除尽残余液体；
[0022]S2
‑
2、取200μL经TBST缓冲液稀释后含有2
×
10
11
pfu的噬菌体溶液，加至步骤S2
‑
1中已封闭好的GST
‑
His包被孔进行预吸附，室温孵育1h；将经过预吸附的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.编码权利要求1所述的人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.权利要求1所述的人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备人肠道病毒71型VP1蛋白：以SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为模板，制备氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的VP1蛋白；S2、生物淘洗：在孔板中加入VP1蛋白和GST蛋白，并接种大肠杆菌菌株和含四环素的培养基，培养；倾去残余液体，加入封闭液，用洗涤液洗涤若干次；加入噬菌体溶液扩增、纯化、洗脱得到洗脱的噬菌体；将洗脱的噬菌体溶液加入大肠杆菌培养物中扩增，分离得到扩增的洗脱液；重复进行第二轮、第三轮筛选，得到筛选出的阳性噬菌斑；S3、扩增阳性噬菌体：将大肠杆菌培养物稀释，蘸取若干分隔良好的蓝色噬菌斑接种培养扩增；然后离心取上清得到扩增的阳性噬菌体；S4、编码噬菌体呈现的多肽的DNA序列测定及氨基酸序列推导和氨基酸序列同源性分析；S5、对筛选出的阳性噬菌体进行ELISA鉴定。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：S1
‑
1、合成如SEQ ID No.3所示的EV71病毒VP1蛋白的cDNA，扩增EV71病毒VP1蛋白的核苷酸序列，将扩增后的序列连接至pFastBac1载体中，得到重组载体VP1
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pFastBac1；S1
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2、将所述重组载体VP1
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pFastBac1转化到大肠杆菌DH10Bac中，得到表达VP1蛋白的杆状病毒穿梭载体，选择2个穿梭载体转染Sf9细胞产生一代病毒P1；S1
‑
3、将步骤S1
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2中Sf9细胞的细胞培养上清、细胞裂解上清和经过重悬的细胞裂解沉淀加入到载样缓冲液中混匀、煮沸、离心，取上清进行10％SDS
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PAGE凝胶电泳，制备背景清晰的干胶保存；对所述干胶进行Western Blot纯化，得到P1病毒储液；S1
‑
4、选取感染复数为1～10的P1病毒储液感染Sf9细胞，确定最佳感染复数，选取最佳感染复数的P1病毒储液进行扩大培养得到二代病毒P2；S1
‑
5、收集P2感染的Sf9细胞的裂解上清，用His60 Ni Superflow Resin对VP1蛋白进行纯化，用含有30mmol/L、50mmol/L、200mmol/L、300mmol/L咪唑的PBS缓冲液分阶段洗脱柱子，收集各浓度梯度洗脱下来的蛋白，对洗脱液进行SDS
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PAGE凝胶电泳分析；S1
‑
6、将步骤S1
‑
5中SDS
‑
PAGE分析结束后的凝胶进行Western Blot鉴定，得到如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：S2
‑
1、在96孔板的2个孔中分别加入200μL用0.1mol/L的NaHCO3溶液稀释的浓度为100μg/mL的VP1
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His溶液和GST
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His溶液，4℃孵育过夜；接种10mL大肠杆菌于含四环素的20mL LB培养基中，37℃培养；取出96孔板，除尽残余液体；加入200μL TBS封闭液，4℃孵育2h；然后用TBST缓冲液洗涤若干次，每次洗涤均除尽残余液体；S2
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2、取200μL经TBST缓冲液稀释后含有2
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pfu的噬菌体溶液，加至步骤S2
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1中已封闭好的GST
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His包被孔进行预吸附，室温孵育1h；将经过预吸附的液体吸出转移入封闭好
的VP1
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His包被孔进行结合，室温孵育1h；倾去液体去除未结合的噬菌体，用TBST缓冲液洗涤若干次，每次洗涤均除尽残余液体；然后用100μL洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦鑫，程华，叶星明，刘静怡，王馨悦，胡捷，刘倩蓉，张文静，赵保明，
申请(专利权)人：湖北文理学院，
类型：发明
国别省市：