一种用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法技术

一种用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法，利用分子生物学中基因敲除技术，敲除玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组上的SSIG_RS21680基因，得到敲除菌株：玫瑰孢链霉菌ΔSSIG_RS21680。本发明专利技术构建好的敲除菌株，达托霉素的产量提升了28.7%。霉素的产量提升了28.7%。霉素的产量提升了28.7%。

【技术实现步骤摘要】
一种用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法。

技术介绍

[0002]达托霉素是一种含有13个氨基酸残基的环脂肽类新型抗生素，它是由玫瑰孢链霉菌经发酵得到的，对革兰氏阳性菌有很强的抗菌活性。其作用机制是通过干扰细菌细胞膜的磷脂结构，破坏了细胞膜骨架，导致细胞死亡，由于达托霉素具有很强的抗菌活性以及独特的抑菌机制，不易与其它抗生素产生交叉耐药性，有着巨大的临床应用价值。
[0003]作为生产达托霉素原始菌株的玫瑰孢链霉菌，其表达量很低，根本无法满足产业化的需求，目前提高达托霉素的产量多是传统方法，比如菌种诱变、发酵工艺的优化等方法。
[0004]菌种诱变工作量大，筛选到优良菌株的概率低，诱变后菌株的稳定性不确定。发酵工艺优化的参数是固定的，优化后无法继续再提高，且工作量大，在技术层面容易到达瓶颈期。
[0005]从基因层面，分子水平改造玫瑰孢链霉菌，从而提升达托霉素的产量是一类新型的方法。通过基因工程等方法构建新的高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌是一种高效、低成本的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的构建方法，其特征在于：利用分子生物学中基因敲除技术，敲除玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组上的SSIG_RS21680基因，得到敲除菌株：玫瑰孢链霉菌ΔSSIG_RS21680。
[0008]优选的技术方案为：包括在NCBI数据库，找到SSIG_RS21680基因处于基因组中的位置，以提取的玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组为模板，以引物ups
‑
F和ups
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R进行PCR扩增得到上游同源臂；
[0009]ups
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F：GAAGATCTAGCCCCGGTCGTCCGCGAGCAGCGAA；
[0010]ups
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R：CCCAAGCTTCGCCCGATGGTGGCAGACGCGGGTGAA；
[0011]以提取的玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组为模板，以引物downs
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F和downs
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R进行 PCR扩增得到下游同源臂；
[0012]downs
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F：GATGAGTTTTTCTAAGGATCCGAGCGGAGAGCCGAGAGCTGAGAG；
[0013]downs
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R：CTATGACATGATTACGAATTCCGGTGGCGGATACGCGGCAGCGGG；
[0014]以pet
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28a为模板，以引物KanR
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F和KanR
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R进行PCR扩增出KanR抗性基因作为筛选基因；
[0015]KanR
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F：CCCAAGCTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACG；
[0016]KanR
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R：CGGGATCCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAA。
[0017]优选的技术方案为：PCR扩增体系为100μL：玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组2μL、上游引物和下游引物各2μL、5
×
高保真DNA聚合酶缓冲液20μL、高保真DNA聚合酶 1.5μL、脱氧核糖核苷三磷酸dNTP混合物10μL、DMSO 5μL、双蒸水补至100μL；PCR扩增参数为：94℃预变性5min，98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸1min 20s，30个循环，72℃延伸5min。
[0018]优选的技术方案为：将PCR扩增得到的上游同源臂连接至pKC1139质粒上，具体方法为：将PCR扩增得到的上游同源臂和pKC1139质粒分别进行BglⅡ/HindⅢ过夜酶切酶切反应体系为：限制性内切酶1μL，浓度为0.5
‑
1.0μg/μL的DNA1μL，10
×
buffer 2μL，ddH2O 补至20μL，温度为37℃，进行过夜反应；酶切结束后进行连接，连接反应体系为：T4 DNA 连接酶1μL，10
×
T4 DNA buffer 1μL，PEG4000 1μL，浓度为0.03pmol/μL的线性载体1μL，浓度为0.1pmol/μL的目的基因3μL，ddH2O补至10μL，温度为22℃，时间为2
‑
3h；连接反应结束后，经大肠杆菌转化后可得到pKC1139
‑
up质粒；大肠杆菌转化的体系如下：感受态细胞E.coli DH5α100μL，连接反应产物10μL，大肠杆菌的转化步骤如下：从超低温冰箱取出感受态细胞置于冰上5
‑
10min，待其自然融化；吸取感受态细胞，将其加入到含有质粒 DNA的离心管中，随后将其置于冰上30min；放置于42℃水浴锅中热击90s，随后置于冰上2min；向管中加入900μL的LB培养基，置于摇床中37℃、200rpm孵育1h；孵育结束后，12000rpm下离心30s得到菌体沉淀，弃去900μL上清液，将剩余的培养基与菌液混匀，涂布于LB固体培养基中；37℃下过夜培养16
‑
18h；再将KanR抗性基因连接至pKC1139
‑
up 质粒上，具体方法为：将KanR抗性基因和pKC1139
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up质粒分别进行HindⅢ/BamHⅠ酶切，酶切反应体系为：限制性内切酶1μL，浓度为0.5
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1.0μg/μL的DNA1μL，10
×
buffer 2μL， ddH2O补至20μL，温度为37℃，进行过夜反应；酶切结束后进行连接，连接反应体系为： T4 DNA连接酶1μL，10
×
T4 DNA buffer 1μL，PEG4000 1μL，浓度为0.03pmol/μL的线性载体1μL，浓度为0.1pmol/μL的目的基因3μL，ddH2O补至10μL，温度为22℃，时间为 2
‑
3h；连接反应结束后，经大肠杆菌转化后可得到pKC1139
‑
up
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KanR质粒；大肠杆菌转化的体系如下：感受态细胞E.coli DH5α100μL，连接反应产物10μL；大肠杆菌的转化步骤如下：从超低温冰箱取出感受态细胞置于冰上5
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10min，待其自然融化；吸取感受态细胞，将其加入到含有质粒DNA的离心管中，随后将其置于冰上30min；放置于42℃水浴锅中热击 90s，随后置于冰上2min；向管中加入900μL的LB培养基，置于摇床中37℃、200rpm孵育1h；孵育结束后，12000rpm下离心30s得到菌体沉淀，弃去900μL上清液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法，其特征在于：利用分子生物学中基因敲除技术，敲除玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组上的SSIG_RS21680基因，得到敲除菌株：玫瑰孢链霉菌ΔSSIG_RS21680。2.根据权利要求1所述的用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法，其特征在于：包括在NCBI数据库，找到SSIG_RS21680基因处于基因组中的位置，以提取的玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组为模板，以引物ups
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F和ups
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R进行PCR扩增得到上游同源臂；ups
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F：GAAGATCTAGCCCCGGTCGTCCGCGAGCAGCGAA；ups
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R：CCCAAGCTTCGCCCGATGGTGGCAGACGCGGGTGAA；以提取的玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组为模板，以引物downs
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F和downs
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R进行PCR扩增得到下游同源臂；downs
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F：GATGAGTTTTTCTAAGGATCCGAGCGGAGAGCCGAGAGCTGAGAG；downs
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R：CTATGACATGATTACGAATTCCGGTGGCGGATACGCGGCAGCGGG；以pet
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28a为模板，以引物KanR
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F和KanR
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R进行PCR扩增出KanR抗性基因作为筛选基因；KanR
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F：CCCAAGCTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACG；KanR
‑
R：CGGGATCCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAA。3.根据权利要求2所述的用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法，其特征在于：PCR扩增体系为100μL：玫瑰孢链霉菌NRRL11379基因组2μL、上游引物和下游引物各2μL、5
×
高保真DNA聚合酶缓冲液20μL、高保真DNA聚合酶1.5μL、脱氧核糖核苷三磷酸dNTP混合物10μL、DMSO 5μL、双蒸水补至100μL；PCR扩增参数为： 94℃预变性5min，98℃变性10s， 62℃退火30s，72℃延伸1min 20s，30个循环，72℃延伸5min。4.根据权利要求1所述的用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法，其特征在于：将PCR扩增得到的上游同源臂连接至pKC1139质粒上，具体方法为：将PCR扩增得到的上游同源臂和pKC1139质粒分别进行Bgl
ꢀⅡ
/Hind
ꢀⅢ
过夜酶切酶切反应体系为：限制性内切酶1μL，浓度为0.5
‑
1.0μg/μL的DNA1μL，10
×
buffer 2μL，ddH2O补至20μL，温度为37℃，进行过夜反应；酶切结束后进行连接，连接反应体系为：T4 DNA连接酶1μL，10
ꢀ×ꢀ
T4 DNA buffer 1μL，PEG4000 1μL，浓度为0.03pmol/μL的线性载体1μL，浓度为0.1pmol/μL的目的基因3μL，ddH2O补至10μL，温度为22℃，时间为2
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3h；连接反应结束后，经大肠杆菌转化后可得到pKC1139
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up质粒；大肠杆菌转化的体系如下：感受态细胞E.coli DH5α 100μL，连接反应产物10μL，大肠杆菌的转化步骤如下：从超低温冰箱取出感受态细胞置于冰上5
‑
10min，待其自然融化；吸取感受态细胞，将其加入到含有质粒DNA的离心管中，随后将其置于冰上30min；放置于42℃水浴锅中热击90s，随后置于冰上2min；向管中加入900μL的LB培养基，置于摇床中37℃、200rpm孵育1h；孵育结束后，12000rpm下离心30s得到菌体沉淀，弃去900μL上清液，将剩余的培养基与菌液混匀，涂布于LB固体培养基中；37℃下过夜培养16
‑
18h；再将KanR抗性基因连接至pKC1139
‑
up质粒上，具体方法为：将KanR抗性基因和pKC1139
‑
up质粒分别进行Hind
ꢀⅢ
/BamHⅠ酶切，酶切反应体系为：限制性内切酶1μL，浓度为0.5
‑
1.0μg/μL的DNA1μL，10
×
buffer 2μL，ddH2O补至20μL，温度为37℃，进行过夜反应；酶切结束后进行连接，连接反应体系为：T4 DNA连接酶1μL，10
ꢀ×ꢀ
T4 DNA buffer 1μL，PEG4000 1μL，浓度为0.03pmol/μL的线性载体1μL，浓度为0.1pmol/μL的目的基因3μL，ddH2O补至10μL，温度为
22℃，时间为2
‑
3h；连接反应结束后，经大肠杆菌转化后可得到pKC1139
‑
up
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KanR质粒；大肠杆菌转化的体系如下：感受态细胞E.coli DH5α 100μL，连接反应产物10μL；大肠杆菌的转化步骤如下：从超低温冰箱取出感受态细胞置于冰上5
‑
10min，待其自然融化；吸取感受态细胞，将其加入到含有质粒DNA的离心管中，随后将其置于冰上30min；放置于42℃水浴锅中热击90s，随后置于冰上2min；向管中加入900μL的LB培养基，置于摇床中37℃、200rpm孵育1h；孵育结束后，12000rpm下离心30s得到菌体沉淀，弃去900μL上清液，将剩余的培养基与菌液混匀，涂布于LB固体培养基中；37℃下过夜培养16
‑
18h；最后将下游同源臂连接至pKC1139
‑
up
‑
KanR质粒上，具体方法为：以pKC1139
‑
up
‑
KanR为模板，利用引物对XXZT
‑
F和XXZT
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R进行PCR扩增，得到带有BamHⅠ/EcoRⅠ限制性酶切位点的线性载体；XXZT
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F：GAATTCGTAATCATGTCATAGCTG；XXZT
‑
R：GGATCCTTAGAAAAACTCATCGAG；将所述线性载体与PCR扩增得到的下游同源臂进行重组反应，重组反应体系为：浓度为0.03pmol/μL的线性化载体1μL，插入浓度为0.06pmol/μL的片段1μL，5
×
buffer 4μL，重组反应酶2μL，ddH2O补至20μL；反应温度为37℃，时间为30min；反应结束后，进行大肠杆菌转化，大肠杆菌转化的体系如下：感受态细胞E.coli DH5α 100μL，连接反应产物10μL；大肠杆菌的转化步骤如下：从超低温冰箱取出感受态细胞置于冰上5
‑
10min，待其自然融化；吸取感受态细胞，将其加入到含有质粒DNA的离心管中，随后将其置于冰上30min；放置于42℃水浴锅中热击90s，随后置于冰上2min；向管中加入900μL的LB培养基，置于摇床中37℃、200rpm孵育1h；孵育结束后，12000rpm下离心30s得到菌体沉淀，弃去900μL上清液，将剩余的培养基与菌液混匀，涂布于LB固体培养基中；37℃下过夜培养16
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18h；经大肠杆菌转化后可得到pKC1139
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KanR
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uds质粒，即为敲除质粒。5.根据权利要求1所述的用于发酵生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌构建方法，其特征在于：所述敲除质粒的验证方法具体步骤为：以构建好的敲除质粒为模板，以上游同源臂正向引物和下游同源臂反向引物进行PCR扩增，上游同源臂正向引物：GAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华，夏理山，常飞，
申请(专利权)人：合肥学院，
类型：发明
国别省市：