用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法，旨在解决采用现有的培养基培养的人工胸腺类器官主要停留在T细胞发育早期阶段的问题。培养基制备方法，包括：将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1∶1

【技术实现步骤摘要】
用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法


[0001]本专利技术属于胸腺类器官培养
，具体涉及一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法。

技术介绍

[0002]胸腺T细胞发育的场所。来源于骨髓(Bone marrow，BM)的共同淋巴祖细胞(Common lymphoid progenitors，CLPs)随血液循环进入胸腺，在皮质胸腺上皮细胞(Cortical thymic epithelial cells，cTECs)和髓质胸腺上皮细胞(Medullary thymic epithelial cells，mTECs)指导下，经历T细胞受体
‑
β(T cell receptor，TCR
‑
β)选择、阳性选择(Positive selection)和阴性选择(Negative selection)等过程后分化为初始T细胞(Naive T cell)。
[0003]经典的T细胞二维培养方法既不能模拟cTECs和mTECs形成的三维(Three
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dimensional，3D)结构，也不能完全满足正常T细胞发育对趋化因子和细胞因子的需求，因此无法培养出具有自身耐受性(Self
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tolerant)和自身限制性(Self
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restricted)的T细胞。
[0004]体外研究需要采用立体结构模拟胸腺基质的微结构。胸腺类器官在一定程度上重现了机体cTECs和mTECs的微环境，使T细胞的体外分化更贴近体内分化过程。胸腺类器官不仅能够长期传代培养，而且其表型和遗传学特性比二维培养产物更加稳定，在模拟器官组织的发生过程及生理病理状态方面优势突出。
[0005]现有的胸腺类器官培养方法是基于细胞系的细胞来构建，或者是利用来自动物模型的胸腺组织进行体外培养，整个过程较为复杂，所用的培养基中需要添加十几种的细胞因子、调控因子，均需要在使用时进行溶解配制，一方面容易产生污染和配制误差，另一方面，随着细胞生物学技术的发展以及新的细胞生长调控信号通路的发现，需要对原有的培养基配方进行持续改进，并且一般的培养基培养成功率较低(低于70％)、培养时间长(6～8周时间)，操作步骤繁琐。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法，旨在解决采用现有的培养基培养的人工胸腺类器官主要停留在T细胞发育早期阶段的问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，包括：
[0009]S100、将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；
[0010]S200、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐
过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；
[0011]S300、将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1:1
‑
1:10的比例混合；
[0012]所述滋养细胞包括两株体积比为1:1
‑
1:4的OP9
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DLL1细胞和MS5
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DLL1细胞。
[0013]进一步改进的方案：在步骤S100中，所述将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括：
[0014]将Pluronic F127用超纯水溶解得到Pluronic F127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；
[0015]将Pluronic F127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100％；
[0016]其中，所述Pluronic F127的质量分数为5％
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45％，所述透明质酸的质量分数为30％
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60％；
[0017]所述质量分数为每100ml中所包含的克数。
[0018]进一步改进的方案：在步骤S100中，所述搅拌形成微球形的凝胶的步骤具体包括：300
‑
1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶。
[0019]进一步改进的方案：在步骤S200中，所述向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶的步骤具体包括：
[0020]通过鼓泡法向凝胶内以100
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250mL/min的气流速度加入空气2
‑
8小时，使凝胶内均匀布满微米级气泡，静置10h
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24h使微米级气泡逐渐过度为10
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100nm的纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，形成空气饱和的微气泡凝胶。
[0021]进一步改进的方案：在步骤S200和步骤S300之间，还包括将微气泡凝胶导入搅拌池中以5000
‑
10000g/min进行搅拌，使微气泡凝胶中气泡稳定的步骤。
[0022]进一步改进的方案：所述滋养细胞包括滋养细胞本体和用于培养滋养细胞的滋养细胞培养基。
[0023]进一步改进的方案：所述滋养细胞培养基为DMEM
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F12培养基。
[0024]进一步改进的方案：所述OP9
‑
DLL1细胞和MS5
‑
DLL1细胞体积比为1:1、1:2、1:3或1:4。
[0025]第二方面，本专利技术提供了一种胸腺类器官的培养方法，包括以下步骤：
[0026]从人骨髓、小鼠骨髓或人脐带血中提取并依次经过磁珠细胞分选和流式细胞分选获取造血干细胞；
[0027]在transwell小室的上室放置第一方面任一方案所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法制备的培养基，在transwell小室的下室放置滋养细胞培养基；
[0028]将造血干细胞在上室中的培养基上培养。
[0029]本专利技术的有益效果为：
[0030]本专利技术中将滋养细胞OP9
‑
DLL1、滋养细胞MS5
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DLL1与微气泡凝胶按一定比例混合，通过中微气泡凝胶纳米级气泡的缓释作用，产生模拟毛细血管网络的氧气弥散和营养物质补充，从而在体外模拟细胞在体内的增长环境，可以实现胸腺类器官的快速生长；滋养细胞OP9
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DLL1、滋养细胞MS5
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DLL1与微气泡凝胶的结合，可以使T细胞的发育到达成熟的阶段，具体表现为成熟的单阳T细胞(如CD4和CD8)增多，DN细胞即幼稚状态的T细胞(包括DN1
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4阶段)较少。
附图说明
[0031本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，包括：S100、将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；S200、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；S300、将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1:1
‑
1:10的比例混合；所述滋养细胞包括两株体积比为1:1
‑
1:4的OP9
‑
DLL1细胞和MS5
‑
DLL1细胞。2.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，在步骤S100中，所述将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括：将Pluronic F127用超纯水溶解得到Pluronic F127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；将Pluronic F127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100％；其中，所述Pluronic F127的质量分数为5％
‑
45％，所述透明质酸的质量分数为30％
‑
60％；所述质量分数为每100ml中所包含的克数。3.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，在步骤S100中，所述搅拌形成微球形的凝胶的步骤具体包括：300
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1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶。4.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，在步骤S200中，所述向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，王运生，
申请(专利权)人：杭州准星医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：