一种利用固态生物质连续发酵生产甘草次苷的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用固态生物质连续发酵生产甘草次苷的方法，转化生产菌株以水稻秸秆、玉米秸秆、麦麸、酒糟等固态廉价生物质为碳源氮源生长，过程中喷洒甘草酸或甘草酸盐，发酵至一定阶段，用去离子水将发酵基质表面的物质冲洗下来，浓缩蒸干，获得甘草次苷（GAMG）粗品。再将冲洗过后的剩余培养基基质中继续补充碳源氮源（廉价生物质），喷洒甘草酸或甘草酸盐，便可实现连续生产。与传统液态转化法相比，本工艺可以连续发酵生产甘草次苷（GAMG），工艺过程简单、生产成本低、无污染，非常适合工业化应用。应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
一种利用固态生物质连续发酵生产甘草次苷的方法


[0001]本工艺涉及微生物工程领域，尤其涉及一种利用固态生物质连续发酵生产甘草次苷的方法。

技术介绍

[0002]甘草酸（GL），又名甘草皂苷、甘草甜素，是一类天然糖苷类化合物，由一分子甘草次酸（GA）作为苷元和两分子葡萄糖醛酸葡糖酸组成的一类五环三萜类皂苷，在中药甘草中是以钠盐或钾盐的形式存在。纯品甘草酸为白色结晶性粉末，无臭，有特殊甜味，熔点220
°
C，易溶于热水，不溶于醚。
[0003]近年来药理研究表明，GL具有解毒、消炎、镇痛、抗肿瘤的作用，还用于防治病毒性肝炎、癌症以及艾滋病等。由于其具甜度高、热能低、气泡性和溶血作用很低且安全无毒等特点，因此在食品和化妆品等工业中均有广泛应用。
[0004]甘草次苷（GAMG）是经GL水解β
‑
1, 2糖苷键得到的产物，白色粉末，甜度高且卡路里较低，甜度约是GL的5倍多、蔗糖的941倍，在提高甜度的同时使口感也有了改善。另外，甘草次苷（GAMG）的LD
50
为5000 mg/kg，约是GL的6倍，并有可能会去除GL排钾阻钠的副作用，同时还具有GL相似的生理活性，这意味着甘草次苷（GAMG）比GL更加安全。近多年以来，大量高热量的甜味剂摄入导致肥胖所引起的一系列心血管疾病、肝病、癌症等已成为社会的一大问题。因此甘草次苷（GAMG）的发展有望为低热量食品开拓新的道路。
[0005]目前甘草次苷（GAMG）的制备方法主要分为化学法和生物法两大类。一是化学合成法合成甘草次苷（GAMG），但合成路线长，收率很低。二是传统的化学水解法，通过水解去掉甘草酸的葡萄糖醛酸基生成甘草次苷，但此法对甘草酸的两个糖苷键选择性低，不能定向水解生成甘草次苷，副产物多，得率较低，同时存在高耗能，高污染的缺点。三是利用微生物所产生的β
‑
D
‑
葡萄糖醛酸酶水解甘草酸而制备得到的，这也是目前甘草次苷（GAMG）的主要获得途径，而其β
‑
D
‑
葡萄糖醛酸酶用量过大，来源不方便也不经济，并且产物较难分离纯化。

技术实现思路

[0006]为弥补上述技术中存在的弊端，本专利技术利用生物转化甘草酸生成甘草次苷（GAMG），其不仅具有专一性高、效率高的优点，而且方法简单、便于分离，是今后获得甘草次苷（GAMG）的理想途径。
[0007]本专利技术将固态生物质作为真菌的碳源和氮源来源，利用真菌将甘草次酸或甘草次酸盐转化为甘草次苷（GAMG）的工艺。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种利用固态生物质连续发酵生产甘草次苷的方法，包括如下步骤：（1）在无菌操作间将转化生产菌株转接至PDA固体斜面上，恒温培养箱中培养，菌丝长满斜面时取出；
（2）用灭菌后的接种环挑取2
‑
3环上述菌丝，转入PDB液体培养基，制成悬浊液，在摇床中培养，培养出种子培养液；（3）将上述种子培养液接种于粉碎后的固态生物质制成的发酵培养基上，在菌体长满整个发酵培养基表面后，喷洒甘草酸或甘草酸盐进行发酵转化生成甘草次苷（GAMG）；（4）用去离子水将固体培养基基质表面的物质冲洗下来，获得甘草次苷（GAMG）粗品；（5）向步骤（4）剩余的培养基基质中，继续喷洒甘草次酸或甘草次酸盐，并补充固态生物质，重复步骤（3）过程；（6）将步骤（4）获得甘草次苷（GAMG）粗品用正丁醇按照1:1的体积萃取3次，将萃取液浓缩，然后用醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液（pH=6.0）溶解，获得GAMG样品溶液，再经过预处理的大孔吸附树脂进行分离纯化，获得甘草次苷（GAMG）；优选的，其特征在于，步骤（1）中转化生产菌株包括球毛壳菌 DX
‑
THS3（Chaetomium globosum DX
‑
THS3），保藏编号为CCTCC NO: M2016005，于2016年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；DX
‑
SEL2（Aspergillus flavus DX
‑
SEL2）, 保藏编号为CCTCC NO: M2013686，于2013年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；DX
‑
SES3（Microsphaeropsis arundinis DX
‑
SES3），保藏编号为CCTCC NO: M2014177，于2014年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；均为实验室前期从东乡野生稻中分离得到，步骤（1）中恒温培养箱培养时温度为28℃。
[0009]优选的，步骤（2）悬浊液培养条件是温度28℃、180 rpm下培养3
‑
6天。
[0010]优选的，步骤（3）中所述用到的发酵培养基由水稻秸秆、玉米秸秆、麦麸、酒糟等固态廉价生物质制成，菌体生长时间是20 d。
[0011]优选的，步骤（4）中，冲洗的次数为2
‑
3次。
[0012]优选的，步骤（5）中所取的固体培养基基质、所喷洒的甘草次酸或甘草次酸盐溶液与步骤（3）相同。
[0013]优选的，步骤（6）中预处理的大孔吸附树脂是：用1～2倍体积的无水乙醇浸泡数次，至浸泡液加入水中无浑浊现象产生。然后去离子水洗至无乙醇味，1～2倍体积的1 mol/L HCl浸泡2 h，水洗至中性，最后用1 mol/L NaOH溶液浸泡，水洗至中性，去离子水保存备用。步骤（6）中分离纯化是：将上述预处理好的大孔吸附树脂以湿法上样，装入玻璃层析柱（280 mm
×
12 mm），树脂床容积为8 mL，树脂沉降后用将水放出，用95%乙醇通过树脂层，洗至流出液澄清透明为止。将配好的上述甘草次苷（GAMG）样品溶液上柱，进样流速调整为1 mL/min通过H103型树脂柱进行动态吸附，流出液弃去前10 mL，之后按照每 8 mL为一份，进行收集。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：（1）利用真菌自身具有的特性制备甘草次苷（GAMG），整个工艺流程简单、经济环保、适合大规模工业应用。
[0015]（2）发酵生产过程连续，只需要向培养基中加入玉米秸秆等廉价生物质，喷洒甘草酸或甘草酸盐，就可以连续获得粗品甘草次苷（GAMG）。
[0016]（3）获得的粗品甘草次苷（GAMG）经过柱层析分离纯化，便可获得高纯度的甘草次
苷（GAMG），纯化过程简单、易操作。
[0017]以上所述，仅为本专利技术较优的具体的实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，凡在本专利技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。
附图说明
[0018]图1 用秸秆粉固态发酵前后对比图图2 用H103树本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用固态生物质连续发酵生产甘草次苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）在无菌操作间将转化生产菌株转接至PDA固体斜面上，恒温培养箱中培养，菌丝长满斜面时取出；（2）用灭菌后的接种环挑取2
‑
3环上述菌丝，转入PDB液体培养基，制成悬浊液，在摇床中培养，培养出种子培养液；（3）将上述种子培养液接种于粉碎后的固态生物质制成的发酵培养基上，在菌体长满整个发酵培养基表面后，喷洒甘草酸或甘草酸盐进行发酵转化生成甘草次苷（GAMG）；（4）用去离子水将固体培养基基质表面的物质冲洗下来，获得甘草次苷（GAMG）粗品；（5）向步骤（4）剩余的培养基基质中，继续喷洒甘草次酸或甘草次酸盐，并补充固态生物质，重复步骤（3）过程；（6）将步骤（4）获得甘草次苷（GAMG）粗品用正丁醇按照1:1的体积萃取3次，将萃取液浓缩，然后用醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液（pH=6.0）溶解，获得GAMG样品溶液，再经过预处理的大孔吸附树脂进行分离纯化，获得甘草次苷（GAMG）。2. 根据权利要求1所述的一种利用固态生物质连续发酵生产甘草次苷的方法，其特征在于，步骤（1）中转化生产菌株包括球毛壳菌 DX
‑
THS3，保藏号为CCTCC NO: M2016005；Aspergillus flavus DX
‑
SEL2, 保藏号为CCTCC NO: M2013686；Microsphaeropsis arundinis DX
‑
SES3，保藏号为CCTCC NO: M2014177均为实验室前期从东乡野生稻中分离得到，并保存于中国典型培养物保藏中心；步骤（1）...

【专利技术属性】
技术研发人员：林楷悦，肖依文，朱笃，张志斌，张浩，高波良，吴文婷，汪涯，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：