基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，本发明专利技术公开了一种基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法：利用质粒pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体，并通过重组病毒TRVe3在植物中表达Cas12a蛋白和转录crRNA，对靶标基因进行定点编辑。本发明专利技术利用病毒TRVe3在表达外源蛋白速度快与含量高的特点对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。

【技术实现步骤摘要】
基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体包括利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)构建在植物中表达Cas12a蛋白载体和表达Cas12a蛋白并转录CRISPR
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derived RNA(crRNA)载体，并利用TRV重组病毒在植物中对靶标基因进行定点编辑。

技术介绍

[0002]基因组定点编辑技术依赖于序列特异性核酸酶在基因组定点位置精准切割双链DNA，造成双链DNA断裂，并激活细胞内的非同源末端连接或同源介导DNA修复。无同源的序列供体DNA，通过NHEJ途径在DNA双链断裂处插入或缺失少量碱基而造成基因突变；存在同源的序列供体DNA，通过HDR途径在DNA双链断裂位置产生精确定点插入或替换。近年来，基因组定点编辑技术的出现，为农作物的精准育种开辟新途径；在水稻、玉米、小麦、马铃薯、番茄和大豆等重要农作物的基因组功能研究和遗传育种改良展现出巨大的应用前景。
[0003]目前基因组定点编辑有3种类型，1)锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术，2)转录激活因子类效应物核酸酶(transcription activator
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like effector nuclease,TALEN)技术，3)串联间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins,CRISPR/Cas)技术，其中CRISPR/Cas技术是目前应用最为广泛的基因组定点编辑方法，成功应用于模式植物、粮油作物、蔬菜、果实、花卉等的产量、品质、抗病以及抗逆性的改良。
[0004]CRISPR/Cas核酸酶如何在细胞中高效表达是植物基因组定点编辑的最重要步骤之一，因植物细胞存在细胞壁，如何快速高效地递送表达CRISPR/Cas核酸酶是植物基因组编辑的主要限制因素。目前，在植物中可通过转基因、非转基因和病毒载体3种方式表达CRISPR/Cas核酸酶，而转基因表达CRISPR/Cas蛋白为最常用的方法。通过农杆菌介导转基因，农杆菌进入植物细胞后，CRISPR/Cas基因随T
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DNA随机整合到植物基因组中并表达，并对靶标基因进行编辑，通过筛选培养基组培再生获得靶标基因编辑的植株。植物转基因流程简单、技术成熟，但亦存诸多不足，1)农杆菌主要侵染双子叶植物，而在单子叶植物转基因则效率低下；2)T
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DNA在植物基因组中随机插入可能到底非预期的遗传性状产生；3)再生植株中Cas蛋白持续过表达增加潜在的脱靶风险；4)转基因需要组织培养、植株再生等过程，工作量大、周期长；基因枪介导的遗传转化和农杆菌介导的T
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DNA插入不同的是通过轰击方式直接将CRISPR/Cas核酸酶基因整合到植物基因组中，克服农杆菌难以侵染单子叶植物的弊端，但由该方法而来的再生植株为多拷贝插入，难以获得不含CRISPR/Cas基因的子代。由于转基因农作物日益受到严格的监管，实现大规模商品化推广非常不容易，无转基因递送CRISPR/Cas核酸酶编辑植物基因组越来越受到重视。无转基因CRISPR/Cas核酸酶递送方式主要有：瞬时表达、原生质体转化以及基因枪轰击。
[0005]病毒具有基因组复制快，蛋白翻译效率高，在寄主植物中产生大量基因组RNA和病毒蛋白，并且基因组小易操作，目前大量病毒用作构建表达外源蛋白的载体。采用病毒载体进行植物基因组的编辑具有巨大优势：1)CRISPR/Cas核酸酶和靶标基因的crRNA随着病毒
的高效复制/翻译而大量产生，提高了靶标基因的编辑效率；2)利用病毒载体编辑植物功能基因，可在较短的时间内获得靶标基因编辑后的生物学表型；3)通过病毒载体可构建多个目的基因的crRNA，可实现多靶标基因的编辑。然而，由于在病毒基因组中可容纳外源基因片段长度非常有限，CRISPR/Cas核酸酶基因长度至少超过3.8kb，利用病毒载体在植物同时表达Cas12a蛋白并转录crRNA非常困难。对植物基因组进行定点编辑往往是利用RNA病毒载体转录靶基因的crRNA，CRISPR/Cas蛋白表达则借助植物转基因。目前，已有TRV、烟草花叶病毒(TMV)、豌豆早枯病毒(PEBV)、马铃薯X病毒(PVX)、甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)和狗尾草花叶病毒(FoMV)等众多的正义单链RNA病毒用作构建转录crRNA的载体，并借助转Cas9基因的植物，用于植物基因组定点编辑。
[0006]苦苣菜黄网(SYNV)是目前报道的在病毒基因组插入Cas9基因和gRNA后能系统性侵染整个本氏烟植株重组病毒，该病毒载体同时表达Cas9和转录靶标基因gRNA后能有效对寄主的外源基因和内源基因进行定点编辑，编辑后的植株呈现相应的生物学表型，可同时实现多靶标的基因定点编辑。SYNV为负链RNA病毒，侵染本氏烟需要通过外源T
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DNA载体表达复制酶N、P和L及多个病毒基因沉默抑制子，且病毒基因组大小为～13.7kb，病毒接种流程和病毒基因组分子操作较为繁琐。由于SYNV分子特性，病毒系统性整个寄主植物周期长，在接种叶有效表达外源蛋白需要6d，接种15d才开始在植株顶部呈现叶片卷曲病毒症状；弹状负链RNA病毒大麦黄色条点花叶病毒(BYSMV)在寄主植物中表达Cas9蛋白则需要14d，并且重组病毒不能系统性侵染，而由其构建的基因编辑体能对靶标基因进行编辑。SYNV寄主为心叶烟、苦苣菜、莴苣等植物，不能侵染马铃薯、番茄和棉花等重要的农作物，因此基于SYNV构建的基因编辑体应用在农作物品种改良的价值受到影响。目前以PVX构建的同时表达Cas9和gRNA载体pPZPVX
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Cas9在本氏烟接种叶能编辑靶标基因；在pPZPVX
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Cas9基因编辑载体中，Cas9基因和靶标基因gRNA是通过PVX的外壳蛋白(CP)亚基因组启动子表达，Cas9的ORF和gRNA在一条RNA分子中，gRNA前体的5
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端含有超过4.2kb核苷酸序列影响靶标基因的编辑效率。由一个FoMV载体表达Cas9及另一个FoMV转录靶标基因的gRNA组成的基因编辑体在本氏烟能编辑靶标基因，但未能对植株的生殖细胞进行基因编辑；由于表达Cas9基因FoMV的基因组大于转录gRNA的FoMV基因组，在病毒增殖过程中，转录gRNA的FoMV占优势，表达Cas9的FoMV含量低，最终影响载体的定点编辑基因的效率。
[0007]TRV是烟草脆裂病毒属(Tobravirus)的典型成员，寄主范围泛，超过50种双子叶和单子叶家族的400多种植物，包括番茄、马铃薯和棉花等重要农作物。TRV为正义单链RNA病毒，基因组由RNA1和RNA2组成；RNA1所编码4个蛋白参与病毒的复制、移动及症状产生，RNA2中包含3个开放阅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：利用质粒pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体，并通过重组病毒TRVe3在植物中表达Cas12a蛋白和转录crRNA，对靶标基因进行定点编辑。2.根据权利要求1所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：利用了重组质粒pTRV2e3，所述pTRV2e3中含有来源于TRV基因组RNA2中的2b SGP和2c SGP序列以及相应的多克隆位点1和多克隆位点2。3.根据权利要求2所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：利用pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白的载体pTRV2e3‑
MCS1
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Cas12a和表达Cas12a蛋白并转录crGFP的载体pTRV2e3‑
crGFP
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Cas12a。4.根据权利要求3所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是载体pTRV2e3‑
crGFP
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Cas12a的构建方法为：1)、PCR扩增Cas12a基因并通过BamHⅠ/SmaⅠ克隆至质粒pTRV2e3，获得载体pTRV2e3‑
MCS1
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Cas12a；2)、通过CRISPR
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P在线软件选择GFP基因的编辑靶点，PCR扩增、双酶切将crGFP序列克隆至质粒pTRV2e3‑
MCS1
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Cas12a中，获得载体pTRV2e3‑
crGFP
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Cas12a。5.根据权利要求4所述的基于烟草脆裂病毒的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法，其特征是：载体pTRV2e3、pTRV2e3‑
MCS1
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Cas12a和pTRV2e3‑
crGFP
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Cas12a农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖乾生，郭歌，赖家良，杜志游，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：