植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用技术

本发明专利技术公开了植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用，所述载体为能表达sgRNA的TRV2载体；TRV2载体内包含表达sgRNA2.0的模块proPeBV

【技术实现步骤摘要】
植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种基因编辑载体，具体为植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用。

技术介绍

[0002]近年来，CRISPR/Cas基因组编辑技术因其准确、高效、简单的操作优势而发展迅速，在植物基因功能研究、遗传育种等方面得到了广泛的应用，已成为分子生物学领域的重要研究手段。目前，在植物基因功能研究方面，CRISPR/Cas技术主要用于创制目的基因功能缺失突变体，即在sgRNA的引导下，Cas蛋白在靶标区域进行DNA双链切割，而后在植物内源DNA修复机制的作用下，使靶标区域发生碱基的插入或缺失，从而使目的基因丧失编码正常蛋白的能力，最终获得目的基因的功能缺失突变体。然而，为了全面科学地研究目的基因的功能，研究者往往还需要创制目的基因过量表达的遗传材料，如果目的基因片段较大、或者要实现多个基因同时过表达，则克隆目的基因片段、构建过量表达载体等过程就会十分繁琐，费时费力。
[0003]随着CRISPR/Cas技术的发展，研究发现，Cas9蛋白的RuvC1和HNH核酸酶结构域各发生一个氨基酸突变后(D10A和H841A)，会形成核酸酶活性丧失的Cas9(dead Cas9，dCas9)。dCas9与sgRNA共同表达时，仍会形成DNA识别复合物，且该复合物只与靶DNA紧密结合而不诱导切割靶基因。基于这样的发现，研究人员将一个组成型转录激活结构域VP64与dCas9形成融合蛋白，在转录水平上实现了目的基因的转录激活。后来，研究者对CRISPR
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dCas9系统激活基因转录的结构进行了优化，陆续开发出了dCas9
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SunTag，dCas9
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TV，dCasEV2.1和CRISPR
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Act2.0等转录激活系统。近期，Pan等人在CRISPR
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Act2.0的基础上，又开发出了比上述几种系统都更加高效的CRISPR
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Act3.0系统，该团队也将Cas12b和SpRY变体等应用到了CRISPR
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Act3.0系统中，实现了靶向富含T的PAM序列或不依赖PAM序列的靶基因激活。然而，该系统主要是在水稻和拟南芥中完成的，而在番茄中仅用了原生质体对其有效性进行了初步探索，在番茄植株中是否有效仍有待研究。此外，跟传统的基因过量表达策略一样，上述基于CRISPR的基因激活系统仍需要进行稳定的遗传转化过程才能获得目的基因过量表达的植物遗传材料，这个过程依然耗时耗力。
[0004]植物病毒载体可以在植物体内高效表达向导sgRNA,从而引导Cas蛋白实现靶基因编辑。在植物中，烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)是一种有效用于病毒诱导基因沉默(Virus
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induced gene silencing，VIGS)的载体，已广泛用于多种植物的功能基因组学研究，如烟草、番茄和棉花等。TRV有一个由两个阳性单链RNA组成的双组分基因组，分别为RNA1和RNA2，并分别被改造为pTRV1与pTRV2两个载体以应用于VIGS。pTRV2可携带并表达外源基因片段用于转录后基因沉默。与基因敲除、转基因、突变体筛选等植物转基因技术相比，VIGS无需构建转基因植株，具有周期短、操作简便、获得表型快速、成本低等优点，已广泛应用于植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导及生长发育等相关基因功能研究，在植物功
能基因组学领域发挥重要作用。Zahir Ali等人在烟草中用TRV2瞬时表达sgRNA，实现了基因敲除。前期研究中，本课题组通过对TRV2载体进行改造，在番茄中瞬时表达一个或多个sgRNA，实现了对番茄单个或多个目标基因的敲除，并利用此技术创制了靶向全基因组的番茄突变体文库。

技术实现思路

[0005]解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，在植物中实现对单个或多个目标基因的敲除，从而能够快速高效的获得不同靶基因的过表达植物材料；鉴于此，本专利技术提供了植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用。
[0006]为实现以上目的，以番茄为例，本专利技术对CRISPR
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Act3.0系统进行了一系列优化，包括启动子替换、转录终止子替换、密码子优化等，大大提高了该系统在番茄中的工作效率，优化后的系统命名为CRISPR
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SlAct3.0，通过遗传转化，我们获得了CRISPR
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SlAct3.0稳定遗传的番茄转基因材料，命名为SlAct3.0 line；同时，我们也对TRV2载体进行了改造，使其表达的sgRNA适用于CRISPR
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SlAct3.0。TRV2携带靶向不同基因启动子区的sgRNA,并在SlAct3.0 line中表达，成功实现了单基因或多基因同时激活表达。利用该系统，我们只需完成一次番茄遗传转化获得SlAct3.0 line植株，而后仅需针对不同的靶标基因，构建含有靶向其启动子区sgRNA的TRV2载体，并侵染SlAct3.0 line幼苗，仅在3周内即可快速高效的获得不同靶基因的过表达植物材料，而通过传统的遗传转化获得基因过表达植株则需要近1年的时间，因此该方法更加快捷高效，省时省力，极大缩短了试验周期。
[0007]技术方案：植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体，所述载体为能表达sgRNA的TRV2载体；TRV2载体内包含表达sgRNA2.0的模块proPeBV
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BsaI
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BsaI
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sgRNA2.0，序列如下SEQ ID NO.9：GAATTCGAGCATCTTGTTCTGGGGTTTCACACTATCTTTAGAGAAAGTGTTAAGTTAATTAAGTTATCTTAATTAAGAGCATAATTATACTGATTTGTCTCTCGTTGATAGAGTCTATCATTCTGTTACTAAAAATTTGACAACTCGGTTTGCTGACCTACTGGTTACTGTATCACTTACCCGAGTTAACGAGGAGACCATCTAGACGGTCTCTGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGTTTT；其中，两个BsaI位点为sgRNA插入位点，采用序列如SEQ ID NO.10：CCGAATTCGAATTCGAGCATCTTGTTCTGG和SEQ ID NO.11：GCGGATCCAAAACAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，并插入到TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体，其特征在于，所述载体为能表达sgRNA2.0的TRV2载体；TRV2载体内包含表达sgRNA2.0的模块proPeBV
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BsaI
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BsaI
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sgRNA2.0，序列如SEQ ID NO.9所示；其中，两个BsaI位点为sgRNA插入位点，采用序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，并插入到TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2
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SG2.0。2.根据权利要求1所述的植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体，其特征在于，含有sgRNA2.0模块的sgRNA2.0
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tRNA序列如SEQ ID NO.12所示，其以TOPO克隆方法连接于载体pCE2，命名为pCE2
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GT2.0。3.根据权利要求1所述的植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体，其特征在于，所述载体TRV2
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SG2.0与多顺反子sgRNA2.0
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tRNA用金门连接法组装，得到TRV2
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multiSG2.0载体。4.权利要求1
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3任一所述植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1、TRV2载体改造人工合成表达sgRNA2.0的模块proPeBV
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BsaI
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BsaI
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sgRNA2.0，序列如SEQ ID NO.9所示；并采用序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，将扩增产物插入TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2
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SG2.0；S2、人工合成sgRNA2.0
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tRNA序列人工合成序列SEQ ID NO.12，并以TOPO克隆方法连接于载体pCE2，命名为pCE2
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GT2.0，后续步骤中pCE2
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GT2.0作为模板使用，以合成不同靶标的sgRNA2.0
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tRNA单元；S3、合成TRV2
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multiSG2.0载体依据金门组装原则设计引物，并以S2中的pCE2
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GT2.0为模板，通过PCR合成多顺反子sgRNA2.0
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tRNA，将多顺反子sgRNA2.0
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tRNA与TRV2
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SG2.0用金门连接法组装，得到TRV2
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multiSG2.0载体。5.根据权利要求4所述的植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体的构建方法，其特征在于，通过金门组装法连接的DNA片段采用II型核酸内切酶酶切。6.根据权利要求5所述的植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体的构建方法，其特征在于，采用的II型核酸内切酶为BsaI、AarI、BbsI、BsmAI或BsmBI。7.权利要求1
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3任一所述植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体在制备番茄单基因或多基因过表达材料中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤：(1)构建CRISPR
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘超超，骆少丹，赵曜，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：