一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用；所述基因编辑载体包括顺序排列的马铃薯Y病毒属病毒从5

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种基因编辑载体及其编辑基因的方法和应用。

技术介绍

[0002]在许多细菌和大部分古细菌中，存在一种可用于抵御外源DNA(如噬菌体)的防御系统，称为CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR
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associated Cas9 endonuclease)系统(Bhaya et al.,2011)。CRISPR/Cas9系统包含两种基本组份，一种是核酸内切酶Cas9蛋白，另一种是gRNA(guide RNA)。在一定条件下，gRNA可与Cas9蛋白形成复合体，通过碱基互补配对，gRNA可以将Cas9蛋白引导至靶标DNA，进而Cas9蛋白可以结合并切割靶标双链DNA，从而造成靶标DNA双链断裂(double strand break)。细胞内的DNA修复机制会对受损的双链DNA进行修复，包括NHEJ(non
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homologous end
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joining)和HDR(homology
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directed repair)(Hsu et al.,2014)。其中大部分情况下为NHEJ发挥主要作用，但是NHEJ修复机制介导的双链DNA的修复往往是不精确的，可能会在被修复的DNA双链中引入不同类型的突变，例如碱基插入，碱基缺失和碱基替换等，进而可能造成靶标DNA功能的改变或者缺失，从而达到“基因编辑”的目的。利用CRISPR/Cas9系统，人们实现了对包括动物，植物，微生物在内的多种生物的基因组的编辑，从而对目标生物的某些性状实现定向改造。例如，通过基因枪将包含CRISPR/Cas9相关组份的瞬时表达载体导入玉米胚中，对玉米的thermosensitive genic male
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sterile 5(TMS5)基因进行编辑，从而在32℃时，可以得到具有雄性不育特性的玉米(Li et al.,2017)。但是这类利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的策略，是建立在瞬时表达载体的基础之上的，需要借助于特殊的外部设备(例如基因枪)将能够表达CRISPR/Cas9组份的质粒导入靶标组织或者细胞中。基于此类方法，能够获得CRISPR/Cas9组份的细胞数目是很有限的，而进入目标细胞的CRISPR/Cas9组份的量也是有限的。为获得目标突变体，往往需要投入大量的时间和人力进行相关操作，例如获取植物未成熟胚和进行组织培养。
[0003]近年来，为了便于将CRISPR/Cas9组份导入靶标组织和细胞，简化操作流程，提高基因编辑的效率，出现了利用植物病毒载体将gRNA导入靶标组织并大量表达，从而实现植物基因编辑目的的报道，例如利用双生病毒、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)对宿主植物基因组进行编辑。
[0004]以双生病毒小麦矮缩病毒(wheat dwarf virus，WDV)为例，WDV是一种植物DNA病毒，作者利用经过改造的WDV大量表达Cas9蛋白和用于HDR修复的DNA模板，实现对內源基因的基因打靶(gene targeting)。得益于经改造的WDV复制子在靶标细胞中高效的复制，其对靶标基因的编辑效率是非病毒载体的12倍(Gil
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Humanes et al.,2017)。经改造的WDV病毒的运动蛋白和衣壳蛋白均被去除，从而丧失运动能力，但是能够高效复制。由于WDV为DNA病毒，作者利用WDV复制子大量表达donor DNA，并作为同源重组修复的模板，实现对植物內源
基因的基因打靶。基于作WDV复制子的基因编辑载体可以同时大量表达Cas9和gRNA，并可以对玉米，小麦，水稻等作物的内源基因进行编辑。
[0005]然而，植物双生病毒为DNA病毒，在侵染植物时，双生病毒可能与宿主细胞竞争复制、翻译等相关因子，干扰植物正常生长，同时也给植物组培再生带来困难。基于双生病毒复制子的基因编辑载体往往无法在植物中进行运动和扩散。此外，双生病毒目前仍然是对农作物威胁最为严重的病毒种类之一，可以造成严重的症状，对作物造成巨大的破坏，且双生病毒可以经由昆虫(例如烟粉虱)进行传播，一旦扩散，难以控制。
[0006]烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)为正义单链RNA病毒，其基因组包含两条RNA链。通过对TRV RNA2进行改造，作者成功利用TRV在本氏烟中表达了gRNA并配合Cas9蛋白，实现对本氏烟内源基因的编辑(Ali et al.,2015)。作者破坏了TRV RNA2上的2b蛋白(线虫传播相关)和2c蛋白(功能未知)表达框，此改造不影响病毒在本氏烟上的系统运动。通过将gRNA克隆至TRV RNA2上CP蛋白表达框的下游，并由同属的豌豆早褐病毒(pea early browning virus，PEBV)启动子(192bp)驱动转录。应用此策略，其成功对本氏烟的注射叶和系统叶的PDS和PCNA基因进行编辑，编辑效率在50％左右。
[0007]然而，TRV的基因组包含两条单链RNA，虽然基于TRV的基因编辑载体保持了系统运动的能力，但是TRV的寄主范围较为有限，其一般不侵染包括大麦，小麦，玉米等重要作物在内的单子叶植物，也不能感染如大豆这样的双子叶作物，从而限制了其在这些重要的农作物上的应用。
[0008]2017年，有研究者报道利用烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)实现对本氏烟內源基因的编辑(Cody et al.,2017)。TMV也是一种单链RNA病毒，作者将TMV的CP蛋白表达框进行缺失，该TMV突变体丧失了在本氏烟中系统运动的能力，但依然保留了复制能力，通过农杆菌浸润的方法可以在本氏烟的农杆菌浸润叶上进行复制。作者将gRNA克隆至MP蛋白表达框之后，并由CP的亚基因组启动子转录gRNA。CP的亚基因组启动子转录起始位点和gRNA之间尚有约60nt的多余碱基，gRNA之后也有近200bp的UTR序列，在此情况下，作者发现此基于TMV的基因编辑载体依然可以对本氏烟内源基因AGO1进行编辑，且效率可达70％。此外作者发现可以直接将多个gRNA进行串联，且它们都可以发挥作用。
[0009]然而，其在设计时，去除了病毒本身的运动蛋白，使病毒丧失了系统运动的能力，使得其发挥作用的部位较为有限。此外，TMV同样不能侵染小麦，玉米等禾本科作物，也不能通过种子进行传播，即不具有直接编辑T0代种子并快速收获靶标突变体的潜力。
[0010]大麦条纹花叶病毒(Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV)属于植物杆状病毒科，大麦病毒属，其基因组包含三条正义单链RN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑载体，其特征在于，包括：顺序排列的马铃薯Y病毒属病毒从5
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UTR区至衣壳蛋白区的序列、gRNA、插入序列和3
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UTR区；所述插入序列任选如下任一：i)编码所述马铃薯Y病毒属病毒的病毒衣壳蛋白的核酸序列；ii)如i)所示核酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸后，仍可以和3
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UTR区的核酸序列形成病毒复制所需的完整RNA元件的核酸序列。2.根据权利要求1所述的基因编辑载体，其特征在于，所述衣壳蛋白区的序列经过密码子优化使其核酸序列发生变化；优选地，优化后的序列和优化前的序列相比没有大于30个碱基的连续的完全一致的同源片段。3.根据权利要求1或2所述的基因编辑载体，其特征在于，当所述插入序列选自ii)时，所述插入序列通过如下流程处理得到：将所述编码所述马铃薯Y病毒属病毒的病毒衣壳蛋白的核酸序列以100
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300nt分为多段，任意去除其中至少一段核酸序列序列，将留下的核酸序列在所述载体中进行病毒复制能力和/或基因编辑效率的评估；若可以顺利进行所述马铃薯Y病毒属病毒的复制和基因编辑，则所述留下的核酸序列即为所述插入序列。4.根据权利要求1
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3任一项所述的基因编辑载体，其特征在于，在所述衣壳蛋白区的序列和所述gRNA之间还包括可以自我切割或被细胞内核酸内切酶切割的核酸序列，优选为编码核酶的核酸序列或Pre
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tRNA。5.根据权利要求4所述基因编辑载体，其特征在于，所述核酶为突变型柱头状核酶；优选地，所述突变型柱头状核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.根据权利要求1所述的基因编辑载体，其特征在于，所述马铃薯Y病毒属病毒包括马铃薯Y病毒(Potato virus Y)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)、菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus)、黑眼豇豆花叶病毒(Bl...

【专利技术属性】
技术研发人员：许凯，张望，智海剑，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：