TP53INP2在增强急性髓系白血病细胞对TRAIL敏感性方面的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学研究技术领域，具体涉及TP53INP2在增强急性髓系白血病细胞对TRAIL敏感性方面的应用。本发明专利技术的目的在于提供一种增强TRAIL治疗急性髓系白血病疗效的策略及方法。本发明专利技术首次检测了AML细胞中TP53INP2的表达水平，发现TP53INP2高表达的白血病细胞对TRAIL治疗的敏感性增加，表明TP53INP2的表达水平可以作为临床上应用TRAIL治疗AML患者的潜在判断指标。此外，本发明专利技术建立了一种能够增强TRAIL治疗AML患者疗效的策略和方法。TRAIL相对不敏感的白血病病人，可通过增加其TP53INP2的表达水平，以提高TRAIL的疗效，从而促进TRAIL治疗在AML患者的临床应用。促进TRAIL治疗在AML患者的临床应用。

【技术实现步骤摘要】
TP53INP2在增强急性髓系白血病细胞对TRAIL敏感性方面的应用


[0001]本专利技术属于生物医学研究
，具体涉及TP53INP2在增强急性髓系白血病细胞对TRAIL敏感性方面的应用。

技术介绍

[0002]急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类造血干细胞克隆增殖性的恶性血液疾病，以髓系白血病细胞异常增生及正常造血细胞受抑制为主要表现，呈高度异质性，是成人最常见的急性白血病类型。目前AML的临床治疗药物主要以阿糖胞苷(cytrarabine，Ara
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c)和柔红霉素(Daunorubicin，DNR)为主，通过干扰DNA合成继而诱发白血病细胞发生凋亡。尽管常规化疗药物在临床治疗上取得了不错的疗效，但是仍有部分患者治疗效果不佳，面临着敏感性差，副作用大和耐药的问题。因此，需要寻找一种新的治疗策略来解决目前临床面临的问题。细胞凋亡包括内源性凋亡和外源性凋亡两种方式，常规化疗药物Ara
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c和DNR诱导的凋亡类型属于内源性凋亡。事实上，通过死亡配体，如Fas，肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，与细胞表面的死亡受体结合进而诱发的外源性凋亡在凋亡过程中也发挥了重要的作用。其中TRAIL诱导的细胞凋亡，因其具有较高的肿瘤特异性和对正常细胞较低的毒性而备受关注。TRAIL在实体肿瘤中相关的研究非常之多，近年来在AML中也逐渐有了应用，但是疗效却相对有限。最近的研究报道，肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白2(tumor protein53
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induced nuclear protein 2，TP53INP2)在部分肝癌细胞中高表达，重要的是，相比其他肝癌细胞，高表达TP53INP2的肝癌细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感性显著增加。此外，在乳腺癌细胞中，也观察到高表达TP53INP2的三阴性乳腺癌细胞在TRAIL处理后呈现更高的凋亡水平。上述研究报道提示TP53INP2在TRAIL诱导实体肿瘤细胞凋亡中扮演着重要的角色。然而，TP53INP2在白血病发生中的作用以及是否增强白血病细胞对TRAIL的敏感性还未见报道。

技术实现思路

[0003]1.为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种增强TRAIL治疗急性髓系白血病疗效的策略及方法。
[0004]2.本专利技术的实施例提供一种实验性验证TP53INP2在增强AML细胞对TRAIL敏感性方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
[0005](1)检测TP53INP2在各个白血病细胞系的表达水平。首先，利用癌症基因百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedi，CCLE)数据库分析在各类白血病细胞系中TP53INP2的基因表达水平；然后，利用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT
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PCR)实验和蛋白质印迹法(western blotting)检测各类白血病细胞系中TP53INP2的基因和蛋白表达水平。
[0006](2)接下来检测TP53INP2的表达水平与白血病细胞对TRAIL的敏感性是否相关。由于在AML中TP53INP2的表达水平与白血病细胞对TRAIL的敏感性是否相关仍然是未知的，故在本实施例中按照如下方式检测。首先利用活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit
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8，CCK
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8)检测TRAIL诱导后各白血病细胞系体外增殖能力的改变情况。最后，利用Western Blotting和流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测TRAIL诱导后各白血病细胞系的凋亡状况。
[0007](3)通过上述实施例，可以表明在AML中TP53INP2的表达水平与白血病细胞对TRAIL的敏感性是否具有相关性。基于上述的发现，在本实施例中，首先构建了pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2的质粒；其次，将构建的pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒瞬时转染于低表达TP53INP2的白血病细胞中，使这类白血病细胞中的TP53INP2表达水平增加。pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒的表达效率通过qRT
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PCR和Western Blotting来验证。
[0008](4)为了验证构建的pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒是否能够增强白血病细胞对TRAIL的敏感性，在本实施例中，首先通过CCK
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8检测试剂盒检测了过表达HA
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TP53INP2质粒后是否增强TRAIL抑制白血病细胞体外增殖的能力；其次通过Western Blotting和FCM检测过表达HA
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TP53INP2质粒后是否增强了TRAIL诱导白血病细胞凋亡的能力。
[0009]综合以上分析，我们提出了以下思路：首先检测在各白血病细胞系中TP53INP2的表达水平(如图1)，然后观察在白血病细胞中TP53INP2表达水平与白血病细胞对TRAIL的敏感性是否相关(如图2和图3)，进而基于上述的发现构建出pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2的质粒并转染于低表达TP53INP2的白血病细胞(如图4)，最后通过实验验证表达的pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒是否增强了白血病细胞对TRAIL的敏感性(图5)。
[0010]3.实验结果
[0011](1)检测TP53INP2在各个白血病细胞系的表达情况。为了检测TP53INP2在白血病细胞中的表达情况，首先利用公共数据库CCLE分析在11种白血病细胞中TP53INP2的基因表达水平，结果如图1A所示，TP53INP2在OCI
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AML3细胞中表达最高，在其余的白血病细胞系中都表达较低。随后，利用qRT
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PCR检测TP53INP2在OCI
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AML3、OCI
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AML2、NB4、THP
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1和KG
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1α细胞中的mRNA表达水平，结果如图1B所示，TP53INP2在OCI
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AML3细胞中表达最高，在OCI
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AML2和THP
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1等细胞中表达则相对较低；最后，通过Western Blotting检测TP53INP2在上述几种细胞中的蛋白表达水平，如图1C所示，结果与mRNA水平一致。以上结果表明，TP53INP2除了在OCI
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AML3细胞外，在其他白血病细胞如OCI
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AML2和THP
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提供一种增强TRAIL治疗急性髓系白血病的疗效的系统及方法，按以下步骤实现：(1)检测TP53INP2在各个白血病细胞系的表达水平。首先，利用癌症基因百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedi，CCLE)数据库分析在各类白血病细胞系中TP53INP2的基因表达水平；然后，利用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT
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PCR)实验和蛋白质印迹法(western blotting)检测各类白血病细胞系中TP53INP2的基因和蛋白表达水平。(2)接下来检测TP53INP2的表达水平与白血病细胞对TRAIL的敏感性是否相关。由于在AML中TP53INP2的表达水平与白血病细胞对TRAIL的敏感性是否相关仍然是未知的，故在本实施例中按照如下方式检测。首先利用活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit
‑
8，CCK
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8)检测TRAIL诱导后各白血病细胞系体外增殖能力的改变情况。最后，利用Western Blotting和流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测TRAIL诱导后各白血病细胞系的凋亡状况。(3)通过上述实施例，可以表明在AML中TP53INP2的表达水平与白血病细胞对TRAIL的敏感性是否相关。在此，首先构建了pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒；其次，将构建的pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒转染于低表达TP53INP2的白血病细胞中，使这类TRAIL不敏感的白血病细胞获得TRAIL敏感性。pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒的表达通过qRT
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PCR和Western Blotting来验证。(4)为了验证构建的pCDNA3.1
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EGFP/HA
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TP53INP2质粒是否能够增强白血病细胞对TRAIL的敏感性，在本实施例中，首先通过CCK
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8检测试剂盒检测了过表达HA
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TP53INP2质粒后是否增强TRAIL抑制白血病细胞体外增殖的能力；其次通过Western Blotting和FCM检测过表达HA
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TP53INP2质粒后是否增强了TRAIL诱导白血病细胞凋亡的能力。2.按照权利要求1所述的提供一种增强TRAIL治疗急性髓系白血病的疗效的系统及方法，其特征在于，步骤(1)所述的利用公共数据库CCLE分析在11种白血病细胞中TP53INP2的基因表达水平的方法如下：TP53INP2在11种白血病细胞中的基因表达数据均来自于癌症基因百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedi，CCLE，https://depmap.org/portal/)数据库。另外，将TP53INP2的基因表达数据从CCLE下载完成后，利用GraphPad Prism(Version 7.00)软件实现可视化。3.按照权利要求1所述的提供一种增强TRAIL治疗急性髓系白血病的疗效的系统及方法，其特征在于，步骤(1)所述的利用qRT
‑
PCR检测TP53INP2的mRNA表达水平的具体方法如下：(1)RNA提取：首先，以1，000rpm
×
5min离心，收集适量状态良好的细胞；弃上清，用预冷的PBS洗2
‑
3次，以3，000rpm
×
3min离心；随后，弃上清，加入1mL RNA提取试剂TRIzol，充分混匀，冰上静置10min；然后，加入TRIzol 1/5体积的氯仿，颠倒混匀，冰上静置后，4℃离心，12，000g
×
15min；吸取上清溶至预冷的新无酶EP管中，加入与氯仿等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置，以12，000g
×
10min的条件4℃离心；弃上清，加入1ml新鲜配制的75％乙醇溶液，清洗沉淀，以13，000g
×
15min的条件4℃离心；弃上清，静置2
‑
3分钟待乙醇挥发完全后，根据沉淀量加入适量DEPC水溶解；最后，测定RNA浓度及纯度。(2)逆转录按表1
‑
1配制逆转录体系，并进行逆转录表1
‑
1 逆转录反应体系(20μL体系)试剂用量
5
×
PrimeScript RT Master Mix4μLTotal RNA1μgRNase Free ddH2OUp to 20μL反应条件：37℃
×
15min，85℃
×
5s，4℃冷却，cDNA于
‑
40℃保存。(3)qRT
‑
PCR实时荧光定量PCR反应体系见表1
‑
2表1
‑
2 QqRT
‑
PCR反应体系试剂用量(μL)cDNA1.0TB Green
TM
Premix Ex Taq
TM
II(Tli RNaseH Plus)5.0Forward primer0.4Reverse primer0.4ddH2O3.2反应条件：第一阶段，95℃预变性30s；第二阶段，95℃变性5s，58℃退火30s，72℃充分延伸20s，采集荧光，循环39次。融解曲线条件：(65℃～95℃)每上升0.5℃采集1次荧光。以β
‑
actin为内参，相对定量值结果采用2
–
ΔΔCt计算。各目的基因的引物由上海生工有限公司合成，序列见表1
‑
3。表1
‑
3 qRT
‑
PCR的引物序列4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伶，黄军鹏，肖巧玲，陶永红，任俊，彭美茜，敬一佩，孙明会，林灿，杨静，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：