一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于引入外来遗传物质对细胞的修饰领域，具体涉及一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用。本发明专利技术的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其保藏号为CGMCC No.45029，于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明专利技术的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系具有以下特点：其一是筛选获得的细胞活力强，传代80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，其二是由于采用非病毒转染思路，对细胞的影响较病毒转染更小，应用范围大，结果的评价性更加准确。结果的评价性更加准确。结果的评价性更加准确。

【技术实现步骤摘要】
一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于引入外来遗传物质对细胞的修饰领域，具体涉及一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]肠上皮细胞是研究上皮细胞生长和分化的重要模型。细胞体外模型可用于评估药物的通过或毒性、肠道致病菌菌株与肠上皮的相互作用，以及涉及消化道的其他生理或病理现象。体外肠屏障的毒理学研究主要基于原代或传代细胞、永生化肠上皮细胞、非肠源细胞系和共培养物的细胞培养。肠上皮细胞是排列在肠腔内的单层细胞，主要功能包括作为阻止外来有害物质如抗原、微生物及其毒素通过肠腔内的屏障；利用跨上皮细胞转运途径和细胞旁路转运途径，选择性通过来自食物中的营养素、电解质和水等物质穿过肠腔进入循环系统。
[0003]因牛、羊等大动物在体内研究中耗时费力等缺点，其肠上皮细胞的建立一直是研究的热点，国内外学者通过不同方法建立了稳定的牛、羊肠上皮细胞模型。但目前技术存在两个问题，首先，目前可以通过胶原酶消化法能够获得一定纯度的奶牛小肠上皮细胞，然而，这些细胞并没有被永生化，体外培养发现这些原代小肠上皮细胞只能仅仅传3
‑
5代并伴随着大量的细胞衰老和凋亡，根本无法满足试验的需求。其次传代培养的肠上皮细胞纯度不够，在大多数物种情况下，从组织块中分离出小肠上皮细胞常常会有成纤维细胞的污染，这两种细胞夹杂生长。由于成纤维细胞增殖速度远远大于上皮细胞，当成纤维细胞增殖到一定程度会包围着小肠上皮细胞生长，最终抑制小肠上皮细胞的生长。
[0004]公告号为CN104928250B的中国专利技术专利公开了一种永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用，其微生物保藏编号为CGMCC NO.8707，其是以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞作为宿主细胞，用携带有SV
‑
40
‑
大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，最终筛选获得稳定传代的永生化奶牛乳腺上皮细胞系。
[0005]肠上皮细胞在涉及消化道的生理或病理研究中具有重要作用。但肠上皮细胞的分离、纯化、培养非常耗时(可达一月至数月之久)，并且不容易分离获得活力很好的细胞，同时分离得到的肠上皮细胞在传至十几代之后即开始衰老并死亡，不能实现永生化。永生化的肠上皮细胞则可大大提高相关应用和研究的进度。通常情况下可使用活病毒载体或质粒转染诱导细胞永生化。使用SV
‑
40
‑
大T抗原的逆转录病毒载体转染，虽然转染效率高，但由于是使用的活病毒，所以在未来的应用上受到限制。而采用质粒转染时，具有较好的应用前景，但较病毒转染获得永生化细胞的难度更大。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，传代近80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，可大幅节省体外细胞模型的构建时间，并提高研究成
果的准确性。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的构建方法。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的应用。
[0009]为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0010]一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其保藏号为CGMCC No.45029。
[0011]本专利技术的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0012]本专利技术的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系具有以下特点：其一是筛选获得的细胞活力强，传代80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，其二是由于采用非病毒转染思路，对细胞的影响较病毒转染更小，应用范围大，结果的评价性更加准确。
[0013]上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：利用胶原酶消化分离小肠上皮细胞，然后利用差速消化法纯化小肠上皮细胞，最后将外源性hTERT基因导入原代荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞，筛选，建立具有正常小肠上皮细胞生物学特性的永生化细胞。
[0014]现有采用慢病毒转染构建细胞系的方法，虽然转染效率高，容易获得具有一定永生特性的细胞株，但由于使用的是活病毒，在未来的应用上受到限制。如采用慢病毒转染构建细胞系的方法往往会出现细胞形态改变、细胞核型发生变化、具有致癌性等问题。若用致瘤性细胞系生产疫苗，疫苗癌基因会随活苗接种而整合入体内，人类若接种有癌基因的疫苗或长期食用整合有癌基因的肉类，有可能出现新一代癌症，酿成新的公共卫生问题。该方法采用非慢病毒转染思路，对细胞的影响小，更适应作为体外细胞模型使用。
[0015]上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系在构建细胞体外模型方面的应用。
[0016]采用本专利技术的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，可避免肠上皮细胞繁琐、漫长的分离培养过程，大幅缩减研究时间；细胞系的同质性优异，可减少批次之间细胞活性差异，有助于获得更为准确的实验结果。
[0017]优选地，所述应用为体外肠屏障的毒理学研究。
[0018]优选地，所述应用为评估药物对肠上皮细胞的通过性或毒性。
[0019]优选地，所述应用为评估肠道致病菌菌株与肠上皮细胞的相互作用。
[0020]优选地，所述应用为评估肠道致病病毒病毒株与肠上皮细胞的相互作用。
附图说明
[0021]图1为本专利技术中牛小肠上皮细胞的原代培养图；
[0022]图2为本专利技术中牛小肠上皮细胞的纯化培养图；
[0023]图3为本专利技术中牛小肠上皮细胞的传代培养图；
[0024]图4为本专利技术中牛原代小肠上皮细胞生长曲线；
[0025]图5为本专利技术中聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因；
[0026]图6为本专利技术中纯化细胞CK18的表达情况；
[0027]图7为本专利技术中hTERT转染牛原代肠上皮细胞系不同代数细胞形态；、
[0028]图8为本专利技术中第36代永生化牛小肠上皮细胞系的生长曲线；
[0029]图9为本专利技术中牛原代肠上皮细胞和牛hTERT转染的P36代肠上皮细胞的聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因图；
[0030]图10为本专利技术中传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞系CK18的表达情况；
[0031]图11为本专利技术中传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的染色体核型分析；
[0032]图12为本专利技术中传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的G
‑
带分析结果；
[0033]图13为本专利技术中第76代永生化牛小肠上皮细胞系的生长曲线；
[0034]图14为本专利技术中牛原代肠上皮细胞和牛hTERT转染的P76代肠上皮细胞的聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因图；
[0035]图15为本专利技术中传至第76代的hTERT转染的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.45029。2.一种如权利要求1所述的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：利用胶原酶消化分离小肠上皮细胞，然后利用差速消化法纯化小肠上皮细胞，最后将外源性hTERT基因导入原代荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞，筛选，建立具有正常小肠上皮细胞生物学特性的永生化细胞。3.一种如权利要求1的永生化荷斯坦公...

【专利技术属性】
技术研发人员：张才，何雷，孟素丹，王海蓉，邵琦，豆梦莹，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：