一种铁死亡激活剂及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于铁死亡激活剂技术领域，尤其是一种铁死亡激活剂及其制备和应用，所述该铁死亡激活剂为抗霉素A，其化学分子式为：C28H40N2O9，S1：砂土管菌种：首先将链霉菌放入砂土管中进行培养；S2：斜面菌种：将经过高温灭菌以后的培养基摆成斜坡式,并将菌种放入斜面培养基中进行培养，培养时间为10天，温度为24

【技术实现步骤摘要】
一种铁死亡激活剂及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及铁死亡激活剂
，尤其涉及一种铁死亡激活剂及其制备和应用。

技术介绍

[0002]铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。铁死亡的主要机制是，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡；此外，还表现为抗氧化体系(谷胱甘肽系统)的调控核心酶GPX4的降低。
[0003]目前对于铁死亡的机制研究多集中在肿瘤性疾病及神经系统疾病方面，认为细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸转运体抑制引起胞内谷胱甘肽水平下降，从而间接降低GPx4的活性。但铁死亡在肾脏方面的研究还很少，有动物实验表明，通过GPx4基因敲除可诱发细胞铁死亡，从而引起小鼠的急性肾衰竭及过早死亡，证实了肾小管上皮细胞铁死亡的存在，且GPx4在其中可能起着至关重要的作用。但以上研究并未涉及到缺氧环境，故在缺氧条件下，肾小管上皮细胞是否会出现铁死亡以及以何种机制诱发铁死亡尚不清楚，为了更好地进行铁死亡的机制研究，寻找新的治疗靶点，拟构建肾小管上皮细胞缺氧损伤模型，观察有无铁死亡的发生。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种铁死亡激活剂及其制备和应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种铁死亡激活剂，所述该铁死亡激活剂为抗霉素A，其化学分子式为：C28H40N2O9。
[0007]一种铁死亡激活剂的制备方法，包括以下步骤：
[0008]S1：砂土管菌种：首先将链霉菌放入砂土管中进行培养；
[0009]S2：斜面菌种：将经过高温灭菌以后的培养基摆成斜坡式,并将菌种放入斜面培养基中进行培养，培养时间为10天，温度为24
‑
26℃；
[0010]S3：摇瓶种子：将S2培养后的菌种接种入装在细胞摇瓶内的液体营养培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子，培养时间为1
‑
2天，温度为25
‑
30℃，pH值调节到6
‑
7后加入0.3％的碳酸钙；
[0011]S4：种子罐种子：将菌种放入种子罐内进行菌株扩大繁殖，培养时间为1天，温度为25℃
‑
30℃；
[0012]S5：发酵放罐：将菌种放入发酵罐内进行发酵，发酵时间为4
‑
5天，温度为25
‑
30℃，发酵完以后对菌种进行放罐处理,并对发酵液进行酸化处理，pH值为3
‑
4；
[0013]S6：浓缩：发酵液酸化后用真空薄膜浓缩器进行减压浓缩；
[0014]S7：干燥：浓缩液打入干燥塔内喷雾干燥，最终得到干燥后的抗霉菌A。
[0015]优选地，所述S2中斜面培养基的培养配方为：麦芽糖0.5％、玉米粉0.5％、酵母膏0.4％、琼脂2％，pH值6.3。
[0016]优选地，所述S3中液体营养培养基的培养配方为：黄豆饼粉5％、豆油2％、葡萄糖1％、KH2PO40.1％，调pH值6.5后加碳酸钙0.3％。
[0017]所述S3中液体营养培养基的罐压4.9
×
10Pa,罐温28℃,通气量1：1。
[0018]优选地，所述S5中发酵罐中的培养配方为：黄豆饼粉2％、玉米粉1.5％、饴糖4％、酵母粉0.4％、鱼粉0.5％、氯化钠0.1％、消泡油0.5％，调pH值6.5后加碳酸钙0.3％。
[0019]优选地，所述S5中发酵罐的罐压为0.05MPa,罐温为30℃,通气量为1：1，菌种放罐后，往发酵液中加入草酸酸化,pH值3
‑
4。
[0020]优选地，所述S6中真空薄膜浓缩器的温度为40
‑
60℃,压力为1.33
×
10
‑
4Pa,流量300kg/h。
[0021]优选地，所述S进干燥塔的热风温度为150℃,排风温度为75℃。
[0022]优选地，一种抗霉素诱导肾小管上皮细胞发生铁死亡的实验研究的应用。
[0023]本专利技术的有益效果为：
[0024]1、本专利技术的铁死亡激活剂及其制备和应用，缺氧在铁死亡发生发展过程中起着至关重要作用，抗霉素A干预肾小管上皮细胞后，使得酶活性升高，在缺氧的肾小管上皮细胞中，铁死亡可能是较早出现的细胞死亡方式，故寻找其新的发病机制，有利于对铁死亡的有效治疗提出新的方向；
[0025]2、本专利技术的铁死亡激活剂及其制备和应用，抗霉素A是一种线粒体细胞色素bc1抑制剂，可以通过阻断细胞的氧化磷酸化过程干扰线粒体ATP的生成，造成ATP缺失，符合缺血缺氧时的肾小管上皮细胞损伤过程，能够广泛用于急性肾损伤肾小管上皮细胞相关研究。
附图说明
[0026]图1为本专利技术提出的一种铁死亡激活剂应用的抗霉素A诱导HK
‑
2细胞损伤图；
[0027]图2为本专利技术提出的一种铁死亡激活剂应用的抗霉素A损伤HK
‑
2细胞释放LDH的检测图；
[0028]图3为本专利技术提出的一种铁死亡激活剂应用的电镜检测细胞线粒体的变化图；
[0029]图4为本专利技术提出的一种铁死亡激活剂应用的去铁胺对抗霉素A损伤HK
‑
2细胞的保护作用图；
[0030]图5为本专利技术提出的一种铁死亡激活剂应用的各组细胞内ROS检测图。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0032]实施例1，参照图1，一种铁死亡激活剂的应用：
[0033]MTT法检测各组细胞存活率：
[0034]HK
‑
2细胞培养于含10％小牛血清的DMEM/F12培养液中，常规培养传代。实验时计数细胞，以细胞3
×
106/瓶均匀接种于50mL培养瓶中，以无血清无糖DMEM/F12培养液+不同
浓度(1，2.5，5，10μmol/L)抗霉素A干预HK
‑
2细胞，作用2，4，8，16，24h后每孔加入5mg/mL的20μl MTT溶液，充分反应后弃上清，每孔加入150μL DMSO，混匀后用酶联免疫法检测仪490nm波长下测每孔光密度值(OD值)，实验重复3次，按照下列公式计算：存活率＝(实验组OD值－空白对照组OD值)/(正常组OD值－空白对照OD值)
×
100％。
[0035]实验结果：抗霉素A诱导HK
‑
2细胞的损伤呈现时效和量效关系。随着抗霉素作用剂量和时间的增加，细胞的存活率呈下降趋势，与正常对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。2.5μmol/L抗霉素A作用HK
‑
2细胞24h后细胞存活率下降至51.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铁死亡激活剂，其特征在于，所述该铁死亡激活剂为抗霉素A，其化学分子式为：C28H40N2O9。2.根据权利要求1所述的一种铁死亡激活剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：砂土管菌种：首先将链霉菌放入砂土管中进行培养；S2：斜面菌种：将经过高温灭菌以后的培养基摆成斜坡式,并将菌种放入斜面培养基中进行培养，培养时间为10天，温度为24
‑
26℃；S3：摇瓶种子：将S2培养后的菌种接种入装在细胞摇瓶内的液体营养培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子，培养时间为1
‑
2天，温度为25
‑
30℃，pH值调节到6
‑
7后加入0.3％的碳酸钙；S4：种子罐种子：将菌种放入种子罐内进行菌株扩大繁殖，培养时间为1天，温度为25℃
‑
30℃；S5：发酵放罐：将菌种放入发酵罐内进行发酵，发酵时间为4
‑
5天，温度为25
‑
30℃，发酵完以后对菌种进行放罐处理,并对发酵液进行酸化处理，pH值为3
‑
4；S6：浓缩：发酵液酸化后用真空薄膜浓缩器进行减压浓缩；S7：干燥：浓缩液打入干燥塔内喷雾干燥，最终得到干燥后的抗霉菌A。3.根据权利要求2所述的一种铁死亡激活剂及其制备和应用，其特征在于，所述S2中斜面培养基的培养配方为：麦芽糖0.5％、玉米粉0.5％、酵母膏0.4％、琼脂2％，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵焕阁，周松林，王华，吕卓旋，曹榕，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：