装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明专利技术制备得到的巨噬细胞膜包被纳米粒具备优良纳米特性，能够高效负载YAP1核酸序列，实现基因干预作用。此外，巨噬细胞膜包被纳米粒制备方法简单、粒径分布均匀且具备良好生物相容性，协同巨噬细胞膜，主动靶向肝纤维化病变炎症部位，调控胶原纤维的生成，进而控制肝纤维化进展。展。展。

【技术实现步骤摘要】
装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属医药制剂
，具体涉及一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肝脏受到病毒、炎症介质、药物副作用、化学试剂等致病因素的持续作用引起慢性肝损伤，造成肝星状细胞(HSCs)持续激活并转化为肝肌成纤维细胞，细胞外基质过量积累，沉积在肝内导致肝纤维化。肝纤维化是由多种细胞因子和分子途径参与的复杂病理变化。肝纤维化发生过程中,多种促炎、促纤维化因子以自分泌和旁分泌的形式作用HSCs使其发生活化和表型转化，活化的HSCs分泌成纤维化因子,刺激门脉纤维细胞、成纤维细胞及骨髓衍生的肌成纤维细胞产生胶原蛋白、促进纤维化。因此，HSCs活化增殖、凋亡、衰老以及静息恢复等过程中涉及的关键分子和信号通路均可作为肝纤维化治疗的潜在靶点。近年来，研究发现，Yes
‑
associated protein 1(YAP1)基因与HSCs的增殖活化有所关联，研究者指出，YAP1的激活是肝星状细胞活化的关键驱动力，激活的YAP1转位到胞核后，促进包括结缔组织生长因子和血小板衍生生长因子在内的促生长基因的上调，这些基因通过转化生长因子和脂多糖通路促进HSCs的增殖和活化，从而加重肝纤维化。因此，抑制HSCs活化过程中YAP1表达的为肝纤维化治疗提供了潜在思路。同时，由于YAP1是参与机体生长发育的关键调节因子，靶向抑制肝脏中活化的HSCs中的YAP1表达成为肝纤维化高效、安全治疗的关键。
[0003]近年来，研究表明，基于纳米颗粒的治疗、预防和检测方式有可能极大地影响疾病管理的方式。随着可用的纳米颗粒种类繁多，基于特定应用的纳米载体的设计已变得越来越普遍。然而，一旦进入体内，纳米颗粒就会遇到一个高度复杂的环境，该环境擅长识别和消除外来元素。例如，在血液中有各种基于蛋白质和细胞的成分，与其中任何一种接触都会迅速影响性能。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。本专利技术利用巨噬细胞膜包被纳米技术，将YAP1
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PLGA通过血液循环招募至肝纤维化病变部位，从而增加YAP1
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PLGA在肝纤维化病变部位的积蓄，增强基因干预作用。本专利技术利用具有良好生物相容性且可降解的PLGA作为纳米载体，负载具有干扰YAP1的质粒，制备纳米颗粒YAP1
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PLGA，并将巨噬细胞膜包被于YAP1
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PLGA纳米颗粒表面，制备得到巨噬细胞膜包被的纳米粒，该纳米粒具备较好的纳米特性，能够实现高效肝纤维化病变部位靶向功能，不但能够有效抑制肝纤维化发展，且具有较好的生物安全性。
[0005]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于，聚乳酸
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羟基乙酸共聚物包载YAP1制备得到YAP1
‑
PLGA纳米粒作为内核，巨噬细胞膜
作为衣壳包覆于YAP1
‑
PLGA纳米粒表面。
[0007]本专利技术所述YAP1核酸序列为GCGGTTGAAACAACAGGAATT。
[0008]上述装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒，YAP1与聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物的质量比为1:9
‑
20。优选YAP1与聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9
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10。最优选YAP1与聚乳酸
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羟基乙酸共聚物的质量比为1∶10。
[0009]所述聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物分子量为3.8
‑
5.4kDa。该分子量的聚合物PLGA构建的纳米粒作为内核，能包载YAP1核酸序列，具有较好的稳定性。
[0010]每10mg聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物使用的巨噬细胞膜提取自1
×
106‑1×
107个巨噬细胞。
[0011]所述的巨噬细胞膜是将巨噬细胞经低渗溶液梯度破碎得到细胞裂解液，采用差速离心及探头超声破碎提取获得。优选所述的低渗溶液梯度具体为细胞悬液依次通过加入含有蛋白酶抑制剂的0.75
×
、0.5
×
、0.25
×
缓冲溶液，冰上裂解2h后探头超声5min使细胞充分裂解，收集细胞裂解液，4℃，1000rpm，5min，小心收集上清；再4℃，14000rpm、20000rpm，10min依次除去细胞碎片、细胞器，收集沉淀以获得巨噬细胞膜。优选所述的将巨噬细胞膜经探头超声破碎的步骤具体为超声强度30％，4℃，5min进一步破碎得到巨噬细胞膜囊泡。将得到的巨噬细胞膜重悬于超纯水中，利用微型膜挤出器依次通过400、200nm聚碳酸酯膜反复挤出10
‑
20次，以获得巨噬细胞膜囊泡用于后续纳米粒包被，将获得的巨噬细胞膜囊泡置于
‑
80℃冰箱储存备用，与既往单一低渗溶液破碎提取方式相比，可高效得到高纯度巨噬细胞细胞膜。
[0012]所述的YAP1
‑
PLGA纳米粒采用纳米沉淀法制备得到，包括如下制备步骤：PLGA用DMSO溶解，加入YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相YAP1
‑
PLGA
‑
DMSO，将溶剂相YAP1
‑
PLGA
‑
DMSO加入到注射溶媒中，于恒温震荡箱中使DMSO挥发，随后将制备得到的YAP1
‑
PLGA用透析袋在注射溶媒中透析，去除游离YAP1核酸序列及有机溶剂，得到YAP1
‑
PLGA纳米粒。
[0013]优选纳米沉淀法步骤如下：精密称取10mg PLGA放入到圆底烧瓶，加入1mL DMSO于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使其充分溶解,随后加入1mg YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相，将上述1mL溶剂相(YAP1
‑
PLGA
‑
DMSO)逐滴缓慢自高处搅拌加入到3mL注射溶媒中，于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使DMSO挥发。随后将制备得到的YAP1
‑
PLGA用透析袋(MW:14000)在注射溶媒中透析24h，去除游离YAP1核酸序列及有机溶剂，得到YAP1
‑
PLGA纳米粒，4℃保存备用。
[0014]上述装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0015](1)将巨噬细胞经低渗溶液梯度破碎得到的细胞裂解液，采用差速离心及探头超声破碎提取得到巨噬细胞膜；
[0016](2)将步骤(1)中得到的巨噬细胞膜使用微型膜挤出器依次通过400、200nm聚碳酸酯膜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物包载YAP1制备得到YAP1
‑
PLGA纳米粒作为内核，巨噬细胞膜作为衣壳包覆于YAP1
‑
PLGA纳米粒表面；所述YAP1核酸序列为GCGGTTGAAACAACAGGAATT。2.如权利要求1所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：YAP1与聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物的质量比为1:9
‑
20。3.如权利要求1所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：YAP1与聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9
‑
10。4.如权利要求1所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：所述聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物分子量为3.8
‑
5.4kDa。5.如权利要求1
‑
4任一项所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：每10mg聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物使用的巨噬细胞膜提取自1
×
106‑1×
107个巨噬细胞。6.如权利要求1
‑
5任一项所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：所述的YAP1
‑
PLGA纳米粒包括如下制备步骤：PLGA用DMSO溶解，加入YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相YAP1
‑
PLGA
‑
DMSO，将溶剂相YAP1
‑
PLGA
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：万敬员，杜慧，杨娴，蒋泞蔓，郭佳诗，钟敏萱，李震寒，帖洪涛，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：