抗炎CD209多肽片段及其抗脂肪性肝病炎症的应用制造技术

本发明专利技术公开了CD209活性多肽的构建及其抗脂肪性肝病炎症的活性；其中，一种CD209活性多肽的构建序列，其包括，氨基酸序列和核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1，核苷酸序列如SEQ ID NO:2；一种CD209活性多肽表达载体的构建方法，其包括，基因合成CD209活性多肽编码cDNA序列，并将其与线性化的pcDNA

【技术实现步骤摘要】
抗炎CD209多肽片段及其抗脂肪性肝病炎症的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，涉及CD209蛋白的一段活性多肽片段的构建及其抗脂肪性肝病炎症及损伤的活性，具体是明确一种CD209的胞内多肽片段的表达及其应用于脂肪性肝病的靶向治疗。

技术介绍

[0002]代谢相关脂肪性肝病(简称脂肪性肝病)是我国第一大慢性肝病，占所有慢性肝病的50％。其主要包括单纯性脂肪肝和脂肪性肝炎，在发病后期由于肝脏炎症可导致肝细胞损伤和死亡，进而引发肝脏组织纤维化和肝癌发生，严重威胁患者健康。脂肪性肝病在我国高发，发病总人数超过2亿，并且随国民经济和营养水平的提高依然处于快速增长之中。脂肪性肝病的发病机制复杂，其中慢性炎症在促进肝脏脂肪蓄积和炎性损伤中发挥核心作用。在脂肪性肝病发生过程中，固有免疫细胞如巨噬细胞和Kupffer细胞等可发生活化，并促进其表面Toll
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样受体(Toll
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likereceptor,TLR)通路活化进而释放促炎细胞因子，如TNF
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α、IL
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1β和IL
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6等，改变肝脏中的糖脂代谢并触发肝细胞损伤，从而介导肝脏中脂肪蓄积和脂肪肝炎的发生。因此，抑制肝脏中慢性炎症的发生可改善脂肪性肝病的病理进程，防止肝脏炎性病变及肝纤维化和肝癌的发生。
[0003]脂肪性肝病发病过程中，巨噬细胞是一类至关重要的炎症调控细胞。正常条件下，巨噬细胞即有促组织炎症和免疫发生功能，也可发挥免疫抑制和耐受活性，这与其活化的表面受体和信号通路存在密切的联系。我们近期通过研究发现抗炎受体分子CD209特异性表达于肝脏巨噬细胞中，并且在脂肪性肝病发生过程中呈现明显的表达下调，CD209的表达可显著抑制巨噬细胞中促炎免疫受体TLR4的表达，从而抑制巨噬细胞的促炎功能，并增强其免疫抑制活性。

技术实现思路

[0004]本专利技术利用基因重组技术构建一段CD209活性多肽片段。本多肽片段可有效清除巨噬细胞中促炎受体TLR4的表达，从而抑制巨噬细胞中多种促炎细胞因子的分泌，进而减轻肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡。本专利技术可以为脂肪性肝病的抗炎治疗提供有效的靶向治疗多肽，为脂肪性肝病临床治疗提供新的生物靶向药物。
[0005]本专利技术提供了如下技术方案：一种CD209的活性多肽片段的构建序列，其cDNA序列和表达的多肽氨基酸序列：
[0006]1GPLVLQLLSFTLLAGLLVQV
[0007]21SKVPSSISQEQSRQDAIYQN
[0008]41LTQLKAAVGELSEKSKLQEI
[0009]61YQELTQLKAAVGELPEKSKL
[0010]81QEIYQELTRLKAAVGELPEK
[0011]101SKLQEIYQELTWLKAAVGEL
[0012]编码cDNA序列：
[0013]1GGGCCGCTCGTTTTGCAACTGCTCAGTTTTACCTTGTTGGCTGGGCTTCTTGTTCAGGTC
[0014]61AGTAAAGTACCTAGTAGCATAAGTCAAGAGCAGAGTAGGCAAGACGCTATCTATCAAAAT
[0015]121CTTACTCAGCTCAAAGCGGCAGTGGGCGAGTTGTCTGAAAAGTCCAAACTGCAAGAAATT
[0016]181TACCAGGAATTGACTCAGCTCAAGGCCGCTGTTGGCGAGCTTCCAGAGAAGTCTAAACTG
[0017]241CAGGAAATATACCAAGAACTCACGAGGCTCAAGGCTGCCGTGGGGGAACTTCCAGAAAAG
[0018]301TCTAAACTTCAAGAAATTTACCAAGAACTGACTTGGCTGAAAGCGGCTGTGGGGGAGCTT
[0019]作为本专利技术的另一方面，本专利技术提供一种CD209活性多肽片段的表达方法，其包括，利用全基因合成技术合成CD209活性多肽的编码cDNA序列，并在限制性内切酶酶切后与线性化的pcDNA
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Flag真核表达载体利用T4连接酶连接，获得重组CD209活性多肽表达质粒；将上述获得的重组质粒转染肝脏分离获得的巨噬细胞。
[0020]作为本专利技术所述的CD209活性多肽片段的表达方法的优选方案，其中：所述限制性内切酶包括BamHI、XhoI中的一种或几种。
[0021]作为本专利技术所述的CD209活性多肽片段的表达方法的优选方案，其中：所述巨噬细胞为从人外周血分离的巨噬细胞。
[0022]作为本专利技术所述的CD209活性多肽片段的表达方法的优选方案，其中：所述转染，将2μg的CD209多肽片段载体与4μl的Fugene脂质体试剂及100μlopti
‑
mem培养基混合并孵育15分钟，进而加入至1
×
106巨噬细胞中，并通过2000rpm离心60min转染，转染CDC42多肽表达载体36小时后，检测多肽表达。
[0023]本专利技术的有益效果：
[0024]本专利技术利用生物工程技术，将一段多肽对应的cDNA编码序列克隆至pcDNA
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Flag真核表达载体中。通过PCR和DNA测序分析证明重组克隆构建成功，并将此真核表达载体转染到巨噬细胞中细胞，通过免疫印迹明确多肽的表达，证明了多肽可在巨噬细胞中发挥功能。进而利用多种功能手段分析其对巨噬细胞介导的肝脏炎症的抑制作用。在细胞生物学层面证明了此多肽具有拮抗巨噬细胞介导的炎症和抑制肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡的重要活性。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0026]图1为脂肪性肝病组织相比于正常肝组织中CD209发生明显表达下调；
[0027]图2为肝组织中CD209主要表达于巨噬细胞中；
[0028]图3为CD209活性多肽片段在巨噬细胞中的转染；
[0029]图4为CD209活性多肽片段抑制巨噬细胞中TLR4表达；
[0030]图5为CD209活性多肽片段抑制巨噬细胞中促炎细胞因子表达(**，P<0.01，相比于对照组)；
[0031]图6为CD209活性多肽片段转导可以抑制肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡(**，P<
0.01，相比于对照组)。
具体实施方式
[0032]如图1所示，脂肪性肝病组织相比于正常肝组织中CD209发生明显表达下调。
[0033]从临床获得活检的正常和脂肪性肝病组织各100mg，加入1ml的组织裂解液后在石英匀浆器中充分匀浆，随本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CD209多肽，其特征在于，其cDNA序列和表达的多肽氨基酸序列为：2.根据权利要求1所述的一种CD209多肽，其特征在于，其编码cDNA序列为：3.一种CD209活性多肽片段的表达方法，其特征在于，包括，利用全基因合成技术合成CD209活性多肽的编码cDNA序列，并在限制性内切酶酶切后与线性化的pcDNA
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Flag真核表达载体利用T4连接酶连接，获得重组CD209活性多肽表达质粒；将上述获得的重组质粒转染肝脏分离获得的巨噬细胞。4.根据权利要求3所述一种CD209活性多肽片段的表达方法，其特征在于，所述限制性内切酶包括BamHI、XhoI中的一种或几种。5.根据权利要求3所述一种CD209活性多肽片段的表达方法，其特征在于，所述巨噬细胞为从人外...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲，
申请(专利权)人：南通市第一老年病医院上海大学附属南通医院，南通市第六人民医院，南通市肺科医院，
类型：发明
国别省市：