用于靶向递送治疗剂的工程化血小板制造技术

本发明专利技术提供了具有嵌合血小板受体(CPR)的工程化血小板，所述嵌合血小板受体具有期望的靶标特异性。此外，所述工程化血小板可包含可在所述血小板激活时释放的货物。此外，所述血小板可在体外由巨核细胞产生，所述巨核细胞经工程化以产生非血栓形成性血小板。工程化以产生非血栓形成性血小板。工程化以产生非血栓形成性血小板。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于靶向递送治疗剂的工程化血小板
[0001]序列表
[0002]本申请与电子格式的序列表一起提交。名为SEQLIST.txt的序列表文件创建于2020年12月14日，大小为46,300字节。序列表中电子格式的信息通过引用整体并入本文。
专利

[0003]本专利技术涉及用于靶向治疗性递送系统的工程化血小板。

技术介绍

[0004]血小板很小且无核，并且不可分裂或繁殖。在人体中，它们执行识别受伤组织并释放其内容物以减少或防止出血的重要功能。来自肾脏和肝脏的促血小板生成素与髓样干细胞接触，导致分化为成巨核细胞(megakaryoblasorphant)，并且其他信号导致成巨核细胞分化为巨核细胞祖细胞。巨核细胞祖细胞是具有血小板前体延伸部的大细胞，其在分裂和增殖时出芽出片段以形成血小板。
[0005]线粒体、微管和囊泡包含在血小板内，并且血小板在被巨噬细胞清除之前具有约10天的寿命。血小板具有约7μm3的体积和300nm的直径。它们具有代谢活性并且可以通过预负载mRNA表达的转录后控制(例如通过miRNA)来改变基因表达。在激活时，颗粒化被刺激以改变细胞内囊泡的形状并释放其内容物。
[0006]血小板通过多样化信号通路受体的集合对多种细胞外信号作出反应。受体既用于触发细胞内信号级联放大，从而导致血小板脱粒和效应物释放，又用于造成血小板聚集和粘附。糖蛋白VI血小板(GPVI)信号传导功能与许多免疫细胞受体
‑
诸如TCR相似。有趣的是，血小板还表达toll样受体(TLR)，并且可以通过肽分泌和免疫系统激活介导细菌的靶向杀伤。
[0007]在血小板脱粒时释放出各种各样的产物。囊泡通过胞吐作用释放。血小板含有三种主要的囊泡亚型：α颗粒(每个血小板50至80个)、致密颗粒(每个血小板3至8个)和大的致密核心囊泡(LDCV)(每个血小板约10,000个)。不同的突变可以选择性地破坏每种囊泡亚型的生物发生。
[0008]α颗粒具有约200至500nm的直径并且占血小板体积的约10％。大多数效应蛋白存在于α颗粒中。例如，从α颗粒中释放的效应蛋白包括：整合膜蛋白，诸如P
‑
选择素、αIIbβ和GPIbα；凝血剂/抗凝血剂和纤溶活性蛋白，诸如因子V、因子IX和纤溶酶原；粘附蛋白，诸如纤维蛋白原和冯维勒布兰德因子(vWF)；趋化因子，诸如CXCL4(细胞因子(C
‑
X
‑
C基序)配体4)，也称为血小板因子4或PF4，以及CXCL12(细胞因子(C
‑
X
‑
C基序)配体12)，也称为基质细胞衍生因子1α或SDF
‑
1α；生长因子，诸如延伸生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子1(IGF)；血管生成因子/抑制剂，诸如血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管抑素；以及免疫介质，诸如免疫球蛋白G(IgG)和补体前体。
[0009]致密颗粒具有约150nm的直径并且占血小板体积的约1％。从致密颗粒中释放的效应蛋白包括阳离子，诸如Ca
2+
和Mg
2+
；多磷酸盐；生物活性胺，诸如血清素和组胺；以及核苷
酸，诸如腺苷二磷酸(ADP)和腺苷三磷酸(ATP)。
[0010]LDCV具有在约150nm至约300nm范围内的直径并且占血小板体积的约13.5％。从LDCV中释放的效应蛋白包括结构蛋白(例如，颗粒蛋白和糖蛋白)；血管调节剂(vascoregulator)(例如，儿茶酚胺、血管形成抑制素、肾素
‑
血管紧张素)；旁分泌信号传导因子(例如，鸟苷素、神经降压素、嗜铬粒蛋白B)；免疫介质(例如，enkelytin和泛素)；阿片类物质(例如，脑啡肽和内啡肽)；离子(例如，Ca
2+
、Na+、Cl
‑
)以及核苷酸和多磷酸盐(例如，腺苷一磷酸(AMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、尿苷
‑
5'
‑
三磷酸(UTP))。
[0011]目前基于工程化嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T细胞)的细胞疗法已显示出治疗癌症的希望；然而，对其安全性的担忧，特别是对患者的致癌性转化的担忧，以及产生一般性或通用性治疗产品的能力有限，将它们的使用局限于少数患者。本领域长期以来一直需要一种新型疗法，所述疗法具有治疗癌症、自身免疫性病状和感染的潜力，而没有困扰当前细胞治疗产品的安全性、成本和患者匹配问题。

技术实现思路

[0012]本文所述的本专利技术的各种实施方案提供了一种嵌合血小板受体(CPR)，其包含：
[0013]a)细胞内结构域，其为血小板刺激结构域并且包含来自免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine
‑
based activation motif，ITAM)受体的结构域；以及
[0014]b)识别并结合靶标的异源靶向结构域。
[0015]通过异源靶向结构域，我们是指靶向结构域对于细胞内血小板刺激结构域是异源的，即靶向结构域不是与细胞内结构域关联的常见细胞外结构域。异源靶向结构域可结合内源性靶标，例如可结合对于受试者为内源性的肿瘤抗原，但是由于CPR是嵌合的，靶向结构域对于内部血小板刺激结构域是异源的。
[0016]本文所述的本专利技术还提供了一种嵌合血小板受体(CPR)，其包含：
[0017]第一区域，其由选自由SEQ ID NO:1
‑
19、24
‑
47和52
‑
55组成的组的核酸序列编码；以及第二区域，其选自由以下各项组成的组：(i)接头或靶向结构域，其由选自由SEQ ID NO:48
‑
51组成的组的核酸序列编码；(ii)选自由以下各项组成的组的蛋白质的至少一部分：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、谷氨酸脱羧酶2(GAD65)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、电压门控钾通道(VGKC)、蛋白脂质蛋白(PLP)、乙酰胆碱受体(AChR)、tribbles假激酶2(TRIB2)、N
‑
甲基
‑
D
‑
天冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受体(GluR)、谷氨酸脱羧酶2(GAD2)、含犰狳重复序列9(ARMC9)、细胞色素P450家族21亚家族A成员2(CYP21A2)、钙敏感受体(CASR)、核自身抗原性精子蛋白(NASP)、胰岛素、促甲状腺激素受体(TSHR)、甲状腺过氧化物酶、去唾液酸糖蛋白受体(asioglycoprotein receptor)、细胞色素P450家族2亚家族D成员6(CYP2D6)、乳铁蛋白(LF)、组织转谷氨酰胺酶(TTG)、H/K ATP酶、因子XIII(F8)、β2
‑
糖蛋白I(β2
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GPI)、红细胞I/I、B2整联蛋白(ITGB2)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合血小板受体，其中所述受体包含：a)细胞内结构域，其为血小板刺激结构域并且包含来自免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)受体的结构域；以及b)识别并结合靶标的异源靶向结构域。2.根据权利要求1所述的嵌合血小板受体，其中所述细胞内结构域包含来自以下各项的一个或多个结构域、其部分或片段：糖蛋白VI(GPVI)、C型凝集素样受体2(CLEC
‑
2)、IgG受体IIa的Fc片段(FCgR2A)、高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ(FCERG)、C型凝集素结构域家族1(CLEC1)或IgG受体II的Fc片段(FCGR2)。3.根据权利要求1或2中任一项所述的嵌合血小板受体，其中来自免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)受体的所述结构域是选自SEQ ID NO:5、7、14和/或19的受体的结构域。4.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合血小板受体，其中所述靶向结构域包含特异性结合所述靶标的靶标结合配体或其片段。5.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合血小板受体，其中所述靶向结构域包含特异性结合所述靶标的抗体或抗体片段。6.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合血小板受体，其中所述靶向结构域包含可变重链结构域和/或可变轻链结构域，任选地scFv。7.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合血小板受体，其中所述靶标是肿瘤抗原、新抗原或自身抗原。8.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合血小板受体，其中所述靶标是：a)与疾病、病症或病状相关的抗原；和/或b)处于受试者体内的靶标组织或细胞上，任选地其中所述靶标组织或细胞是癌组织或细胞。9.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合血小板受体，其中所述靶标与所述异源靶向结构域的结合导致包含所述嵌合血小板受体的血小板的脱粒。10.一种核酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的嵌合血小板受体。11.根据权利要求10所述的核酸，其还包含巨核细胞特异性启动子。12.根据权利要求10或11中任一项所述的核酸，其中所述核酸可操作地连接至异源表达序列，任选地异源启动子。13.一种载体，其包含根据权利要求10
‑
12中任一项所述的核酸。14.一种病毒载体或病毒颗粒，其包含根据权利要求10
‑
12中任一项所述的核酸或根据权利要求13所述的载体。15.一种巨核细胞或其祖细胞，包含：(a)根据权利要求1
‑
9中任一项所述的嵌合血小板受体；和/或(b)根据权利要求10
‑
12中任一项所述的核酸；和/或(c)根据权利要求13所述的载体；和/或(d)根据权利要求14所述的病毒载体或病毒颗粒。16.根据权利要求15所述的祖细胞，其为诱导多能干细胞(iPSC)、造血干细胞或骨髓祖细胞。17.一种工程化血小板，其包含根据权利要求1
‑
9中任一项所述的嵌合血小板受体、根
据权利要求10
‑
12中任一项所述的核酸、根据权利要求13所述的载体和/或根据权利要求14所述的病毒载体或颗粒。18.一种基因修饰的巨核细胞或其祖细胞，其具有降低的血栓形成潜力；和/或能够产生具有降低的血栓形成潜力的血小板。19.根据权利要求18所述的基因修饰的巨核细胞或其祖细胞，其包含至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或至少十种基因的破坏或缺失，所述基因选自编码以下各项的基因的组：参与识别血栓形成的初级刺激的蛋白质；参与识别血栓形成的二级介质的蛋白质；和/或参与释放血栓形成的二级介质的蛋白质。20.根据权利要求18或19所述的基因修饰的巨核细胞或其祖细胞，其中所述巨核细胞或其祖细胞包含至少以下各项的破坏或缺失：一种编码参与识别血栓形成的初级刺激的蛋白质的基因；一种编码参与识别血栓形成的二级介质的蛋白质的基因；以及一种编码参与释放血栓形成的二级介质的蛋白质的基因；任选地包含至少以下各项的破坏：两种编码参与识别血栓形成的初级刺激的蛋白质的基因；两种编码参与识别血栓形成的二级介质的蛋白质的基因；以及两种编码参与释放血栓形成的二级介质的蛋白质的基因；任选地包含至少以下各项的破坏：三种编码参与识别血栓形成的初级刺激的蛋白质的基因；三种编码参与识别血栓形成的二级介质的蛋白质的基因；以及三种编码参与释放血栓形成的二级介质的蛋白质的基因。21.根据权利要求19或20所述的基因修饰的巨核细胞或其祖细胞，其中：编码参与识别血栓形成的初级刺激的蛋白质的所述至少一种、两种或三种基因选自由以下各项组成的组：GPIb/V/IX和GPVI(GP6)、ITGA2B、CLEC2、整联蛋白a
IIb
b3、a2b1、a5b1和a6b1，或选自由GPVI和ITGA2B组成的组；编码参与识别血栓形成的二级介质的蛋白质的所述至少一种、两种或三种选自由以下各项组成的组：Par1、Par4、P2Y12、GPIb/V/IX、血栓素受体(TBXA2R)、P2Y1、P2X1和整联蛋白a
IIb
b3或选自由Par1、Par4和P2Y12组成的组；和/或编码参与释放血栓形成的二级介质的蛋白质的所述至少一种、两种或三种基因选自由Cox1、HPS和血栓素A合酶(TBXAS1)组成的组，或选自由Cox1和HPS组成的组。22.根据权利要求18
‑
21所述的基因修饰的巨核细胞或其祖细胞，其中以下基因中的每一种均被破坏或缺失：GPVI、ITGA2B、Par1、Par4、P2Y12、Cox1和HPS。23.根据权利要求15所述的巨核细胞或其祖细胞或根据权利要求18
‑
22所述的基因修饰的巨核细胞或其祖细胞，其中由所述巨核细胞或其祖细胞或由所述基因修饰的巨核细胞或其祖细胞产生的所述血小板：a)对通常导致凝块形成的内源性刺激无反应；
b)不被其他活化的血小板募集；和/或c)在激活时，不能募集和激活患者的内源性血小板。24.根据前述权利要求中任一项所述的工程化巨核细胞或其祖细胞，其中所述破坏包括改变编码所述血小板受体的所述基因的表达，任选地用R...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯，
申请(专利权)人：JPV零一有限公司，
类型：发明
国别省市：