一种细胞基因组稳定性的调控方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种细胞基因组稳定性的调节方法，包括：采用含20

【技术实现步骤摘要】
一种细胞基因组稳定性的调控方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种细胞调节方法，特别是涉及一种提升细胞基因组稳定性的调节方法及其应用。

技术介绍

[0002]基因组是遗传信息的重要载体，其完整性对于维持细胞功能十分重要。然而有许多因素(如细胞代谢、环境压力和药物刺激等)都会造成DNA损伤，DNA损伤信号的积累会阻碍基因转录和基因组复制，从而进一步激活细胞周期检查点并抑制细胞分裂。正常情况下细胞内存在完整的DNA损伤修复机制，可以通过多种途径修复基因组中的损伤位点，但是如果修复机制缺陷或损伤压力超过了修复极限，大量基因组中未修复的损伤斑块促使基因组不稳定并最终可能导致受损细胞凋亡、衰老以及癌变。除了DNA损伤修复机制的缺失，复制压力过高及核膜完整性受损等因素同样会导致细胞基因组不稳定，说明基因组稳定性的调控是复杂且多元的，而基因组是否稳定也会直接影响细胞功能和命运。
[0003]虽然现有的技术可以通过联用不同损伤修复机制的小分子抑制剂进一步促进基因组的不稳定，从而利用合成致死原理清除癌细胞等原本基因组稳定性脆弱的细胞，但无法预防正常细胞过早出现基因组不稳定以维持其正常生理功能甚至延缓衰老。换言之，目前鲜有细胞基因组稳定性的有效调控方法。
[0004]在基因缺陷的小鼠模型研究中，研究者发现诸如Xrcc5和Ercc1等DNA损伤修复基因缺失小鼠和核纤层蛋白LMNA成熟机制缺失小鼠都出现细胞基因组不稳定、心血管疾病发生和早衰的表型。人类疾病研究显示基因组稳定性的缺陷与几种类早衰综合征有关，如早年衰老综合征、沃纳综合征、毛发硫营养不良等。但由于基因组稳定调控机制的多元性，现实中很难通过增强个别DNA损伤修复机制或单纯维持核膜完整性来抵御复杂因素导致的细胞基因组不稳定，其主要原因为这些直接的效应分子都是起特定功能的下游蛋白，并不是上游的信号节点，难以从整体上对细胞基因组稳定性进行调控。并且这些效应分子发挥功能的机制各异，使得研究者想要恰当的激活其在胞内的功能也极具挑战。综上，现在亟需找到一种安全可控的上游信号从整体上调节细胞的基因组稳定性，这对于维持细胞正常生理功能、延缓细胞衰老具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术以细胞为例提供了一种细胞基因组稳定性的调节方法及其应用，以对细胞基因组稳定性进行调控。
[0006]本专利技术提供了一种细胞基因组稳定性的调节方法，包括：
[0007]采用含20
‑
200ng/mLVEGF调节因子的ECM培养基对细胞培养6
‑
1000h，所述VEGF调节因子为VEGF蛋白、VEGF抗体中的一种。
[0008]进一步地，所述VEGF蛋白为VEGF
‑
B蛋白，所述VEGF抗体为VEGF
‑
B抗体。
[0009]更进一步地，所述VEGF
‑
B蛋白为重组人VEGF
‑
B蛋白。
[0010]进一步地，所述调节方法具体包括：
[0011]步骤1：采用ECM完全培养基进行细胞培养，至80％以上密度；
[0012]步骤2：采用无ECGS的ECM培养基对步骤1所得细胞进行饥饿处理2
‑
6h；
[0013]步骤3：向步骤2培养基中加入VEGF调节因子，使VEGF调节因子含量达到20
‑
200ng/mL，培养12h。
[0014]更进一步地，所述步骤2中无ECGS的ECM培养基含0.5％FBS。
[0015]进一步地，所述ECM培养基为ECM完全培养基。
[0016]本专利技术还公开一种应用上述细胞基因组稳定性调节方法的细胞炎症衰老指标和基因组稳定性检测方法，包括：
[0017]步骤1：取VEGF调节因子培养后的细胞，采用PBS对细胞进行清洗，并使用0.05％胰酶消化2
‑
5分钟，加入1
‑
5mL 0.5％FBS的ECM终止消化；
[0018]步骤2：在室温下200g离心3
‑
5分钟步骤1所得样品，弃去上清；
[0019]步骤3：对步骤2所得样品进行基因物质提取，并检测。
[0020]进一步地，所述步骤3包括：
[0021]取TRNzol对细胞进行裂解，并抽提RNA，进行逆转录，采用qPCR检测炎症衰老相关基因的mRNA水平。
[0022]进一步地，所述步骤2具体包括
[0023]在室温下200g离心3
‑
5分钟步骤1所得样品，弃去上清；取PBS重悬细胞，取15,000
‑
25,000个细胞，在室温下200g离心3分钟，弃去上清；用150
‑
250μL 37℃预热的0.5％低熔点琼脂糖胶重悬细胞，每50
‑
100μL悬液涂于一张1％常规熔点琼脂糖胶处理过的载玻片上，冰上凝固5
‑
10分钟；对获取的样品进一步经8000J/m
2 UVC照射，再涂50
‑
100μL 37℃预热的0.5％低熔点琼脂糖胶于样品层上，冰上凝固5分钟，整个过程低温避光操作。
[0024]更进一步地，所述步骤3包括：
[0025]取裂解液进行细胞裂解，在4℃下处理过夜；样品转移至盛有足量碱性电泳液的电泳槽中，在4℃下浸泡30
‑
60分钟后，采用20V电泳30分钟；将获取的样品转移至4℃预冷的TBS中，中和5分钟，流水洗涤玻片10分钟；处理后的样品用70％乙醇脱水5
‑
15分钟，在37℃下烘干琼脂糖胶层，在5μg/mL DAPI下于4℃避光染片20分钟，PBS洗1
‑
5分钟后用抗荧光淬灭封片剂封片镜检测。
[0026]本专利技术还公开一种细胞基因组稳定性的长期调节方法，其特征在于，所述调节方法包括：
[0027]步骤1：采用ECM完全培养基进行细胞培养；
[0028]步骤2：向步骤1培养基中加入VEGF调节因子，使VEGF调节因子含量达到50
‑
150ng/mL，培养至90％以上密度时传代。
[0029]步骤3：保持步骤1和步骤2的条件进行连续培养，并检测。
[0030]本专利技术相对于现有技术，采用VEGF调节因子对细胞基因组的稳定性进行有效调控，从而达到有效预防正常细胞过早出现基因组不稳定、维持细胞状态并抑制细胞衰老或与之相反的效果，实现对细胞基因组稳定性的有效调控。
附图说明
[0031]图1为本专利技术实施例1激活VEGF
‑
B信号通路细胞基因组稳定性测试图；
[0032]图2为本专利技术实施例2激活VEGF
‑
B信号通路抑制炎症衰老相关基因表达统计图；
[0033]图3为本专利技术实施例3激活VEGF
‑
B信号通路细胞抑制细胞复制性衰老测试图；
[0034]图4为本专利技术对照例1免疫荧光染色检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞基因组稳定性的调节方法，其特征在于，所述调节方法包括：采用含20
‑
200ng/mL VEGF调节因子的ECM培养基对细胞培养6
‑
1000h，所述VEGF调节因子为VEGF蛋白、VEGF抗体中的一种。2.根据权利要求1所述一种细胞基因组稳定性的调节方法，其特征在于，所述VEGF蛋白为VEGF
‑
B蛋白，所述VEGF抗体为VEGF
‑
B中和抗体。3.根据权利要求2所述一种细胞基因组稳定性的调节方法，其特征在于，所述VEGF
‑
B蛋白为重组人VEGF
‑
B蛋白。4.根据权利要求1所述一种细胞基因组稳定性的调节方法，其特征在于，所述调节方法具体包括：步骤1：采用ECM完全培养基进行细胞培养，至80％以上密度；步骤2：采用无ECGS的ECM培养基对步骤1所得细胞进行饥饿处理2
‑
6h；步骤3：向步骤2培养基中加入VEGF调节因子，使VEGF调节因子含量达到20
‑
200ng/mL，培养12h。5.根据权利要求4所述一种细胞基因组稳定性的调节方法，其特征在于，所述步骤2中无ECGS的ECM培养基含0.5％FBS。6.根据权利要求1所述一种细胞基因组稳定性的调节方法，其特征在于，所述ECM培养基为ECM完全培养基。7.一种应用权利要求1
‑
6任一项所述细胞基因组稳定调节方法的细胞基因组稳定性检测方法，其特征在于，所述细胞基因组稳定性检测方法包括：步骤1：取VEGF调节因子培养后的细胞，采用PBS对细胞进行清洗，并使用0.05％胰酶消化2
‑
5分钟，加入1
‑
5mL 0.5％FBS的ECM终止...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旭日，刘熠，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：