一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶制造技术

本发明专利技术公开了一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶。本发明专利技术首先采用超高速离心法分离得到干细胞外泌体，以干细胞外泌体、维生素B、I型胶原蛋白、海藻糖和甘油复配制备得到一种发挥治疗糖尿病足功效的干细胞凝胶。经试验证明，将其用于糖尿病足创面的治疗，创面面积逐渐缩小，且能缩小糖尿病足溃疡体积，使创面重新长出新的肉芽组织，使组织逐渐恢复。使组织逐渐恢复。使组织逐渐恢复。

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶


[0001]本专利技术属于生物医药和干细胞技术应用领域，涉及一种用于治疗糖尿病足的干细胞制剂，尤其是一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶。

技术介绍

[0002]糖尿病足(diabetic foot,DF)是糖尿病的并发症之一，是一种慢性、进行性的累及血管、神经、肌腱、骨骼的病变。其发生是在下肢周围血管病变、周围神经病变的基础上合并感染、继而溃疡形成和(或)深部组织的破坏。患者常因足部感染和坏疽导致截肢致残，甚至死亡，尤其下肢动脉硬化闭塞引起足部缺血性病变是截肢致残的主要因素。该病截肢率、致死率高，病程长、难治愈，给患者家庭和社会造成了重大负担。近年来，糖尿病病足溃疡和足坏疽的患者正在增加；据估计，全球每20秒就有1位糖尿病患者因糖尿病足而截肢；目前我国糖尿病足呈现出治愈率提高、截肢率明显下降，但发病率却逐年升高的趋势。
[0003]糖尿病足的治疗一直是临床慢性伤口治疗中的难题。积极控制血糖，增强体质，可以减缓糖尿病足的发展；高压氧疗，中医疗法、药物疗法等可减轻炎症反应，促进创面修复，但是都不能使已受损的神经血管修复。近几十年来，干细胞技术作为细胞治疗中最具革命性的技术，对于开发多种疾病的新疗法，促进人类健康有着巨大的应用潜能。多项研究表明，干细胞在治疗糖尿病足方面具有显著效果，为糖尿病足的治疗提供了新的选择。
[0004]干细胞主要通过分泌一些细胞因子(如上皮生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、膀岛素生长因子
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1、血细胞生长因子、成纤维因子、黏连蛋白、IL
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6、IL
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8、TNF
‑
β、TNFR
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I、Leptin和血管蛋白
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1)作用于信号调节通路，激活成纤维细胞和内皮细胞，促进其迁移増殖分化，从而促进血管生成。并且，激活的成纤维细胞和内皮细胞也能分泌血管内皮生长因子和上皮生长因子，进一步促进血管生成。血管生成能够增加缺血区的血液供给，因此，缺血性溃疡的愈合能力增强。另外，细胞因子能抑制伤口处的炎症反应，进而加速伤口愈合。除此之外，干细胞还能分化成内皮细胞。上皮细胞和内皮细胞分别是促进溃疡愈合和血管生成的两大细胞。此外，干细胞分化过程形成的内皮祖细胞通过分泌细胞因子HIF
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α和IL
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8，可抑制促凋亡蛋白Bax和PUMA的表达，同时增加抗凋亡蛋白Bcl
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x和Bcl
‑
2的表达，从而起到抑制凋亡的作用。
[0005]外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，包含了复杂RNA和蛋白质类物质，具有脂质双层膜结构，直径大约为30
‑
150nm。外泌体存在于绝大多数细胞中，其功能取决于其来源的细胞类型，广泛参与了机体免疫应答、细胞分化、细胞通讯、抗原递呈等生物过程，在创伤医学、组织工程、精准诊断和精准治疗等领域具有良好的临床应用前景。有文献报道，干细胞来源的外泌体具有抑制炎症反应、促进血管生成、参与组织修复等功能，与干细胞相比，干细胞来源的外泌体使用更安全，无任何免疫排斥反应，更容易质控和大规模生产。但是，外泌体需要维持其活性，需要较高的保存条件，短期保存在4℃，长期储存需要置于
‑
80℃深低温，不方便使用。因此，需要开发一种发挥其功效的用于治疗糖尿病足的凝胶，便于直接使用。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶。本专利技术首先采用超高速离心法分离得到干细胞外泌体，以干细胞外泌体、维生素B、I型胶原蛋白、海藻糖和甘油复配制备得到一种发挥治疗糖尿病足功效的干细胞凝胶。经试验证明，将其用于糖尿病足创面的治疗，创面面积逐渐缩小，且能缩小糖尿病足溃疡体积，使创面重新长出新的肉芽组织，使组织逐渐恢复。
[0007]本专利技术的技术方案如下：一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶，其特征是，每10mL的干细胞凝胶中包含0.01
‑
0.1g的维生素B、0.1
‑
0.5g的海藻糖、0.08
‑
0.15g的I型胶原蛋白、0.2g
‑
1g的甘油和终浓度为10
‑
200μg/mL的干细胞外泌体，调节pH7.2
‑
7.4。
[0008]制备方法：在冰上混匀，0.22μm过滤除菌，室温下冷却即为干细胞凝胶。
[0009]使用方法：采用3％过氧化氢和生理盐水各冲洗3遍糖尿病足后，再用碘伏消毒创面，涂抹干细胞凝胶，用无菌纱布包扎，每日早晚各一次。
[0010]其中，干细胞外泌体采用超高速离心法分离得到，具体为：
[0011]S1：选择对数生长期(P3
‑
P5代)的间充质干细胞，待细胞融合度达到80
‑
90％，采用胰酶消化，然后加入含5％No
‑
exo
‑
血清替代物的完全培养基培养48
‑
72h，收集培养上清液，用于提取外泌体；
[0012]S2：将上清液1000
‑
2000g离心，去除细胞碎片、完整细胞和死细胞，获得上清液；
[0013]S3：将上清液继续10000
‑
20000g离心，去除沉淀后获得上清液；
[0014]S4：使用0.22μm过滤器过滤上清液，放入超速离心机100,000g离心2
‑
3h；
[0015]S5：弃上清，用预冷的PBS缓冲液清洗获得的沉淀，放入超速离心机100,000g，离心3
‑
6h；
[0016]S6：弃上清，沉淀用预冷的PBS缓冲液重悬，即获得外泌体，浓度为1
‑
5mg/mL，分装后置于
‑
80℃储存。
[0017]含5％No
‑
exo
‑
血清替代物的完全培养基，其具体配方为：先将血清替代物(商品名：EliteGro
TM
‑
Advanced)放入超速离心机离心，获得不含外泌体的血清替代物，即为No
‑
exo
‑
血清替代物；将No
‑
exo
‑
血清替代物加到MSCBM培养基中，混匀即得5％No
‑
exo
‑
血清替代物的完全培养基。
[0018]上述对数生长期的间充质干细胞的获取方法为：
[0019](1)细胞均来源于脐带、脂肪或胎盘组织；
[0020](2)原代培养：脐带组织分离出华通胶，剪碎组织，贴壁法培养间充质干细胞；脂肪和胎盘组织采用混合酶消化法，获得单个细胞后置于培养瓶中，放在37℃、5％CO2培养箱中培养；
[0021](3)传代培养：原代融合度达到80
‑
90％，胰酶消化法收集细胞进行传代培养；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶，其特征是，每10mL的干细胞凝胶中包含0.01
‑
0.1g的维生素B、0.1
‑
0.5g的海藻糖、0.08
‑
0.15g的I型胶原蛋白、0.2g
‑
1g的甘油和终浓度为10
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200μg/mL的干细胞外泌体。2.如权利要求1所述的一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶，其特征是，所述干细胞凝胶pH7.2
‑
7.4。3.如权利要求1所述的一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶，其特征是，所述干细胞外泌体采用超高速离心法分离得到。4.如权利要求3所述的一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶，其特征是，所述超高速离心法具体为：S1：选择对数生长期的间充质干细胞，待细胞融合度达到80
‑
90％，采用胰酶消化，然后加入含5％No
‑
exo
‑
血清替代物的完全培养基培养48
‑
72h，收集培养上清液，用于提取外泌体；S2：将上清液1000
‑
2000g离心，去除细胞碎片、完整细胞和死细胞，获得上清液；S3：将上清液继续10000
‑
20000g离心，去除沉淀后获得上清液；S4：使用0.22μm过滤器过滤上清液，放入超速离心机100,000g离...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈莉，邓长江，李春娜，尚现岗，夏冬梅，
申请(专利权)人：山东赛恩福干细胞工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：