一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法。该方法包括：一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得外周血单个核细胞；一部分细胞直接冻存，另一部分细胞，通过流式细胞仪分选出CD3

【技术实现步骤摘要】
一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法


[0001]本专利技术涉及一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，属于细胞培养和细胞库构建领域。

技术介绍

[0002]细胞治疗是指获取人自体或异体来源的具有特定功能的活细胞，经体外分离、纯化、培养、扩增、冻存、复苏、质检合格后，回输入人体，起到治疗疾病和抗衰老的作用。根据细胞类型，细胞治疗可分为干细胞治疗、免疫细胞治疗和体细胞治疗等。
[0003]从1960年，老鼠骨髓中的不断增殖及可分化的造血干细胞的发现，人们渐渐认识到干细胞的存在，到英国科学家在1997年克隆出多利羊，意识到干细胞的再生作用，再到山中伸弥利用体细胞成功诱导出多能干细胞(iPSC)，50年的时间内，干细胞技术发展迅速，人们开始希望能够通过干细胞来治疗各类重大疾病以及再生各种组织器官。随着2012年诺贝尔医学奖颁给诱导多能干细胞(iPSC)，干细胞的潜在医学应用在世界各国得到了更为广泛的重视，而随着中国老龄化进程的加快，利用存储的干细胞进行个体化治疗的前景也越来越接近现实。干细胞治疗是再生医学革命最先进的临床治疗技术，该本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，包括以下步骤：S1：一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得外周血单个核细胞；一部分细胞直接冻存；S2：步骤S1除冻存以外的另一部分细胞，通过流式细胞仪分选出CD3
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淋巴细胞，进行CIK细胞扩增培养，编码冻存；S3：步骤S2分选出CD3
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淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD56
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淋巴细胞，进行NK细胞扩增培养，编码冻存；S4：步骤S3分选出CD56
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淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD34
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细胞进行MSC细胞培养，再编码冻存。2.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所述步骤S1的一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得外周血单个核细胞，具体为：1)将肝素钠采血管中的外周血转入离心管中，离心；离心完毕后，将上层血浆制备成自体血浆备用；2)离心后的下层外周血加入生理盐水吹打混匀，然后加入到淋巴细胞分离液中，再次离心；3)取离心管中间白膜层细胞加生理盐水颠倒混匀，离心，弃上清，再重复1
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3次，沉淀即为外周血PBMC。3.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所述步骤S1的部分细胞直接冻存为：将部分外周血PBMC加入免疫细胞冻存液重悬细胞进行冻存，细胞密度为2～3
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106个/mL；所述免疫细胞冻存液按体积份数，其成分为：1～5％的自体血浆，10％的DMSO，10％的6％右旋糖酐
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40葡萄糖注射液，75％～79％的羟乙基淀粉，总量100％。4.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所述步骤S2进行CIK细胞扩增培养为：1)分选后的CD3
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细胞中加入KBM581或X
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VIVO15培养基重悬，加入INF
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γ，置于培养箱中培养；2)第2天，加入IL
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2和CD3 Ab，继续培养；第4
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5天，补加完全培养基，3)第6天，计数，如果细胞密度达到1～2
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106，将所有细胞转到细胞培养袋中，补加完全培养基，然后第8～10天，继续补加完全培养基；4)第14天，离心，弃掉上清液，加入生理盐水清洗，收集CIK细胞。5.如权利要求4所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所述加入的INF
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γ终浓度100～1000IU/mL，IL
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2终浓度1000
±
200IU/mL、CD3 Ab的终浓度20～200ng/mL；所述完全培养基为：含1000
±
200IU/mL IL
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2的KBM581或X
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VIVO15培养基。6.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所述步骤S3进行NK细胞扩增培养为：1)分选出的CD56
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈莉，邓长江，尚现岗，李春娜，夏冬梅，王范，
申请(专利权)人：山东赛恩福干细胞工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：