一种激酶抑制剂的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种激酶抑制剂的高通量筛选方法，包括如下步骤：(1)采用多个浓度的抑制剂对激酶进行抑制处理，然后利用多重等重标签对激酶活性位点多肽进行标记，富集没有跟抑制剂结合的多肽；(2)针对较高丰度激酶活性位点多肽采用数据依赖模式质谱分析，针对较低丰度激酶活性位点多肽采用选择离子监测模式质谱分析。该方法分析通量较高，检测灵敏度较高，所需样本量较少，大大提高了激酶抑制剂筛选以及IC50值测定的准确度和效率。IC50值测定的准确度和效率。IC50值测定的准确度和效率。

【技术实现步骤摘要】
一种激酶抑制剂的高通量筛选方法


[0001]本专利技术涉及一种激酶抑制剂的高通量筛选方法。

技术介绍

[0002]蛋白激酶是一系列复杂细胞功能和通路中的关键酶，广泛参与细胞信号传导，其突变或异常表达导致许多疾病(包括癌症)的发生发展，是药物研发的重要靶标。以蛋白激酶作为药物靶点，寻找与之相互作用的小分子化合物，并进一步优化用于新药研发是当今蛋白激酶研究领域的一个重要方向。现有的激酶抑制剂筛选方法采用每个浓度单独液相色谱
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质谱分析，使用非标定量对各个浓度作用下的激酶活性位点多肽进行相对定量分析；这种方法分析通量低，灵敏度低，准确度低。针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种激酶抑制剂的高通量筛选方法，该方法分析通量较高，检测灵敏度较高，所需样本量较少，大大提高了激酶抑制剂筛选以及IC50值测定的准确度和效率。
[0004]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：
[0005]一种激酶抑制剂的高通量筛选方法，包括如下步骤：
[0006](1)采用多个浓度的抑制剂对激酶进行抑制处理，然后利用多重等重标签对激酶活性位点多肽进行标记，再富集没有跟抑制剂结合的多肽；
[0007](2)针对较高丰度激酶活性位点多肽采用数据依赖模式质谱分析，针对较低丰度激酶活性位点多肽采用选择离子监测模式质谱分析。
[0008]进一步的，步骤(1)中，在对激酶进行抑制处理后，利用脱硫生物素核苷酸探针与激酶的未抑制活性位点反应；富集时，利用嫁接了链霉亲和素的琼脂糖树脂微球材料富集含脱硫生物素核苷酸探针的多肽。
[0009]更进一步的，在富集前，活性位点被抑制剂和核苷酸探针反应后的激酶依次经还原、烷基化和胰蛋白酶酶切。
[0010]更进一步的，经过胰蛋白酶酶切后的多肽还经过除盐处理，然后经过洗脱处理。
[0011]进一步的，所述质谱分析采用液质联用串联质谱仪。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0013]1)多重等重标记后的多肽在串级质谱中产生的报告离子的强度用于相对定量，有效克服了传统非标定量在液相色谱
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质谱联用分析中产生的方法和系统误差，定量准确度较非标定量高；
[0014]2)多重标记后的多个样本等质量混合后只需一次液相色谱
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质谱分析，成倍节省了仪器分析的成本，同时也成倍提高了分析的通量；
[0015]3)等重多重标记后的多肽因为等重在一级质谱中叠加出峰，提高了检测的灵敏度，同时所需要的样本量也成倍减少。
80％ACN进行洗脱；洗脱液组合后真空浓缩至干。
[0034]将浓缩至干所获得的六组多肽分别用等重多重标签(如ThermoFisher TMT 127N、127C、128N、128C、129N和129C)按厂家提供的操作流程进行标记。将标记后的各组多肽混合后用嫁接了链霉亲和素的琼脂糖树脂微球材料富集含脱硫生物素核苷酸探针的多肽，也就是没有跟抑制剂结合的多肽。
[0035]二、质谱分析
[0036]基于数据依赖模式质谱采集的较高丰度激酶活性位点多肽的分析
[0037]富集后的多肽混合物经数据依赖C18
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RPLC
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NanoESI
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MS/MS(液质联用串联质谱仪)质谱分析及数据库搜索，获得激酶活性位点多肽的保留时间、前体及碎片离子价态、产物离子分布。
[0038]首先，在Dionex Ultimate 3000RSLCnano HPLC系统(Thermo Fisher Scientific)上，用20cm长的分析柱(360μod
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75μmid)填充C18颗粒(75μmid)填充C18颗粒(1.7μm)来分离。流动相A是99.8％H2O和0.2％FA的混合物。流动相B是95.0％ACN，4.8％H2O和0.2％FA的混合物。在1小时梯度下以300nL/min的恒定流速进行洗脱：以2％的流动相B和98％的流动相A进行5分钟的上样，45分钟内流动相B的体积比为2
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40％，然后在5分钟内流动相B体积比增加至95％，再保持5分钟。
[0039]然后，使用nanoESI Q Exactive串联质谱在线检测洗脱的多肽。一级谱质量分辨率为70k(m/z 200)，采谱范围为m/z 350
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1800，自动增益控制(AGC)目标值和最大离子注入时间分别为1e6和50ms。二级谱质量分辨率设置为35k(m/z 200)，以高能碰撞解离(HCD)在数据依赖模式(Top20)下获得二级质谱，AGC和最大离子注入时间分别为2e5和250ms。囚禁窗口和动态排除时间设置为0.7m/z和20.0s。梯度碰撞能量设置为30.0％。离子传输管的温度设定为320℃，电喷雾电压设定为1.9kV。
[0040]最后，使用多肽搜索引擎对上述液相色谱
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质谱联用分析获得的数据组进行数据库搜索；数据库采用人全蛋白质数据库；将烷基酰胺甲基化氨基甲酸酯(分子量57.02Da)设置为半胱氨酸上的静态修饰，脱硫生物素(分子量196.12Da)设置为赖氨酸上的动态修饰。基于等重标签各自报告离子的强度对各浓度下未被抑制的激酶活性位点多肽进行相对定量。
[0041]基于选择离子监测模式质谱采集的较低丰度激酶活性位点多肽的分析
[0042]较低丰度激酶活性位点多肽在同样的色谱分离条件下，基于选择离子监测模式质谱采集进行更高灵敏度和准确度的靶向分析。基于所获得的保留时间、质荷比以及特征碎片离子建立低丰度多肽靶向监测列表，并输入到采集流程进行靶向检测。
[0043]基于数据依赖模式质谱分析和基于选择离子监测模式质谱分析各自获得的多肽鉴定(Identifications，IDs)组合给出激酶活性位点多肽的IDs、相对强度；利用活性多肽被抑制百分比相对于抑制剂浓度做图，在50％被抑制处获得该活性位点的IC50值。
[0044]基于本专利技术方法分析HeLa细胞中星形孢菌素对不同激酶的抑制效果，所获得的代表性结果如表1所示；相关详细信息包括基因名称、AC号、蛋白简称、蛋白全称、活性位点氨基酸序列、活性位点以及星形孢菌素的IC50值。
[0045]表1
[0046][0047]本专利技术的分析方法基于多重等重定量标记和单次液相色谱
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串级质谱联用分析，有效克服了传统非标定量在液相色谱
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质谱联用分析中产生的方法和系统误差，定量准确度较非标定量高，成倍节省了仪器分析的成本，同时也成倍提高了分析的通量，提高了检测的灵敏度，且所需要的样本量也成倍减少。
[0048]对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本专利技术进行了示例性描述，显然本专利技术具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本专利技术的方法构思本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种激酶抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用多个浓度的抑制剂对激酶进行抑制处理，然后利用多重等重标签对激酶活性位点多肽进行标记，再富集没有跟抑制剂结合的多肽；(2)针对较高丰度激酶活性位点多肽采用数据依赖模式质谱分析，针对较低丰度激酶活性位点多肽采用选择离子监测模式质谱分析。2.根据权利要求1所述的一种激酶抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，在对激酶进行抑制处理后，利用脱硫生物素核苷酸探针与激酶的未抑制活性位点反应；富集时...

【专利技术属性】
技术研发人员：马浩伟，
申请(专利权)人：汉诺生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：