一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法及其使用的微流控芯片技术

本发明专利技术涉及一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法及其使用的检测芯片，该方法包括以下步骤，S1：磁珠表面经过修饰连接有第一抗体，其与含有目标免疫分子的待测样品溶液孵育，得到结合有目标免疫分子的磁珠；S2：用洗涤液对磁珠进行洗涤；S3：将磁珠与荧光微球进行孵育，形成免疫夹心复合物，荧光微球结合有第二抗体，第二抗体也可特异性地与目标免疫分子进行结合；S4：对步骤S3孵育后的磁珠进行洗涤，从而得到经过纯化后的磁珠悬液，S5：将步骤S4得到的磁珠悬液注入到检测板上并进行检测。本发明专利技术所提供的检测方法无需在芯片上加工大量的微井并对每个微井进行油封，从而减少了检测芯片加工的复杂程度，也降低了芯片的生产成本。本。本。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法及其使用的微流控芯片


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法及其使用的微流控芯片。

技术介绍

[0002]蛋白质是生物体重要的生物大分子，其参与了生物众多的理化反应，也是临床诊断中重要的生物标志物。通过对蛋白质进行监测以判断人体是否处于健康状态，因此，复杂生物样品中蛋白质检测的灵敏度和定量的准确性对于疾病早期诊断来说都是至关重要的。例如，近几年流行的病毒COVID
‑
19，其衣壳和包膜组分由特异性蛋白质—RBD蛋白、全长S蛋白及核蛋白(N)组成，因此可以利用抗原
‑
抗体结合的原理进行免疫学检测。
[0003]数字ELISA是一种基于磁珠的免疫测定方法，该方法是在毫米级的芯片上雕刻或浇筑成千上万个微米级微井，微井的大小恰好可容纳单个磁珠，磁珠捕获待测蛋白靶分子，再添加结合了SβG（链霉亲和素
‑
β
‑
半乳糖苷酶偶联物）的检测抗体进一步标记目标分析物，从而，在磁珠上形成由捕获抗体、目标分析物、检测抗体和SβG组成的免疫复合物，捕获有免疫复合物的磁珠被分配到与其尺寸接近的微井中，微井中同时填满了磁珠溶液中的荧光底物resorufin
‑
β
‑
d
‑
galactopyranoside(RGP)，同时使用密封油将酶
‑
底物反应的荧光产物限制在微井内，最后利用高分辨率荧光显微镜对荧光点进行计数。当磁珠的数目足够大，大部分磁珠只捕获一个蛋白靶分子或者零蛋白靶分子，从而每个微井中仅含有一个或者零个蛋白靶分子，从而实现单分子光学信号放大。由于含捕获抗体磁珠的数量多于目标分析物的数量，酶标记免疫复合物与磁珠的数量关系符合泊松分布，便于对检测结果的数据进行理论分析；通过微孔阵列的白光图像来计算芯片阵列中的磁珠总数，而免疫复合物微孔数与含磁珠总孔数的比值称为“on beads”，与目标蛋白浓度相关。
[0004]目前基于微阵列的数字酶联免疫吸附分析仪，虽然极大地提高检测的灵敏度，使检测基本达到单分子水平，但是该类方法需要在毫米级的芯片上雕刻或浇筑成千上万个微米级微井，这极大地提高了芯片设计、加工难度和生产成本。目前已经有一些研究在探索、开发更快速、成本低廉的数字化检测方法。如专利CN202010416301.8，通过一种虚拟分隔生物靶标的方法来实现数字化的检测，该专利虽然避免了数字化检测中采用的物理分割微井，降低了芯片的加工难度和成本，但是该芯片在设计上仍然较为存在较多问题。首先，该芯片需要采用特殊的芯片并对芯片基地进行特殊修饰，加入大量能和发光底物共价结合的基团，同样存在增加加工难度的问题；另外，该检测方法在平铺检测时需要加入超声设备，这将极大地增加设备的体积和操作的复杂度；此外，该方法中酶催化生成的发光分子存在于开放的溶液环境中，虽然发光分子共价连接到了芯片基板表面，但是仍存在局部大范围的扩散可能，从而影响检测的识别，尤其是对于几个磁珠酶联复合物距离较近时，可能将无法分割和识别。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法及其使用的微流控芯片，以解决上述问题。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是：一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法，该方法包括以下步骤：S1：磁珠表面经过修饰连接有第一抗体，第一抗体可特异性与目标免疫分子进行结合，经修饰后的磁珠与含有目标免疫分子的待测样品溶液孵育，所使用磁珠的数量远大于待测目标免疫分子的数量，经孵育后得到结合有目标免疫分子的磁珠；S2：用洗涤液对步骤S1中结合有目标免疫分子的磁珠进行洗涤；S3：将经步骤S2洗涤后的磁珠与荧光微球进行孵育，从而形成具有荧光标记的磁珠—目标免疫分子的免疫夹心复合物，所述的荧光微球结合有第二抗体，第二抗体也可特异性地与目标免疫分子进行结合；S4：对步骤S3孵育后的磁珠进行洗涤，从而得到经过纯化后的磁珠悬液，该磁珠悬液包括：具有荧光标记的磁珠
‑
目标免疫分子的免疫夹心复合物、不含荧光标记的结合有目标免疫分子的磁珠；S5：将步骤S4得到的磁珠悬液注入到检测板上；S6：将注有磁珠悬液的检测板转移至检测区，并对其进行检测和计算。
[0007]优选地，所述的检测板选自盖玻片、细胞计数板或检测芯片中的任意一种。
[0008]优选地，所述的磁珠直径为d1，1μm≤d1≤10μm，该磁珠表面至少有1000个识别点位，且磁珠的数量为n，200000个≤n≤600000个；所述的荧光微球直径为D，100nm≤D≤500nm。
[0009]优选地，所述的检测板为检测芯片，该检测芯片内设置有空腔，该空腔依次包括检测窗、腔室连通道和废液池，检测窗上还连通有加样孔，此时，步骤S5至少包括以下步骤：将步骤S4所得到的磁珠悬液通过加样孔加入到检测芯片内，磁珠悬液注满检测窗，多余的磁珠悬液则经腔室连通道进入废液池中，位于检测窗中的磁珠则分散在检测窗中。
[0010]优选地，所述的检测板为检测芯片，该检测芯片内设置有空腔，该空腔依次包括检测窗、腔室连通道和废液池，检测窗上还连通有加样孔，此时，步骤S5至少包括以下步骤：a1：将步骤S4所得到的磁珠悬液通过加样孔加入到检测芯片内，磁珠悬液注满检测窗，多余的磁珠悬液则经腔室连通道进入废液池中，位于检测窗中的磁珠则分散在检测窗中；a2：将步骤a1中的检测芯片缓慢放置于磁性装置顶部，磁性装置覆盖检测窗，静置8
‑
12min。
[0011]优选地，步骤S6至少包括以下步骤：将检测芯片转移至检测区，在白视场下对检测芯片的检测窗进行拍照扫描以统计出白视场下的磁珠数目Qn，在荧光视场下对检测芯片的检测窗进行拍照扫描，以统计出荧光视场下的荧光微球数目Fn。
[0012]本专利技术第二方面提供了一种检测芯片，该检测芯片用于上述的一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测，该检测芯片包括底板和盖体，底板顶部开设有空腔结构，该空腔结构记为检测窗，检测窗一侧的盖体顶部开设有注液孔，注液孔与检测窗相连通，检测窗另一侧的底板顶部开设有废液池，废液池与检测窗间隔设置且二者之间通过腔室连通道相连
通，废液池远离腔室连通道一侧的底板顶部开设有排气槽，排气槽与废液池相连通。
[0013]优选地，注液孔处的盖板顶部固定连接有注液柱，注液柱内开设有注液通道注液孔下部的芯片内部开设有缓冲池，缓冲池与检测窗之间通过流道相连通，注液柱顶部的外边缘沿其周向固定连接有定位环。
[0014]优选地，流道从缓冲池到检测窗的方向宽度逐渐扩大，流道内靠近缓冲池的一侧固定连接有第一阻隔件，第一阻隔件的两侧与流道的内侧壁间隔设置，第一阻隔件将靠近缓冲池一侧的流道分隔为两个第一通道，流道内靠近检测窗的一侧固定有至少两个第二阻隔件，相邻的两个第二阻隔件间隔设置，第一阻隔件靠近检测窗的端部与第二阻隔件靠近检测窗一侧的端部相平齐，第二阻隔件与第一阻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：S1：磁珠表面经过修饰连接有第一抗体，第一抗体可特异性与目标免疫分子进行结合，经修饰后的磁珠与含有目标免疫分子的待测样品溶液孵育，所使用磁珠的数量远大于待测目标免疫分子的数量，经孵育后得到结合有目标免疫分子的磁珠；S2：用洗涤液对步骤S1中结合有目标免疫分子的磁珠进行洗涤；S3：将经步骤S2洗涤后的磁珠与荧光微球进行孵育，从而形成具有荧光标记的磁珠—目标免疫分子的免疫夹心复合物，所述的荧光微球结合有第二抗体，第二抗体也可特异性地与目标免疫分子进行结合；S4：对步骤S3孵育后的磁珠进行洗涤，从而得到经过纯化后的磁珠悬液，该磁珠悬液包括：具有荧光标记的磁珠
‑
目标免疫分子的免疫夹心复合物、不含荧光标记的结合有目标免疫分子的磁珠；S5：将步骤S4得到的磁珠悬液注入到检测板上；S6：将注有磁珠悬液的检测板转移至检测区，并对其进行检测和计算。2.根据权利要求1所述的一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法，其特征在于：所述的检测板选自盖玻片、细胞计数板或检测芯片中的任意一种。3.根据权利要求2所述的一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法，其特征在于：所述的磁珠直径为d1，1μm≤d1≤10μm，该磁珠表面至少有1000个识别点位，且磁珠的数量为n，200000个≤n≤600000个；所述的荧光微球直径为D，100nm≤D≤500nm。4.根据权利要求3所述的一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法，其特征在于：所述的检测板为检测芯片，该检测芯片内设置有空腔，该空腔依次包括检测窗、腔室连通道和废液池，检测窗上还连通有加样孔，此时，步骤S5至少包括以下步骤：将步骤S4所得到的磁珠悬液通过加样孔加入到检测芯片内，磁珠悬液注满检测窗，多余的磁珠悬液则经腔室连通道进入废液池中，位于检测窗中的磁珠则分散在检测窗中。5.根据权利要求4所述的一种基于荧光标记免疫法的蛋白质定量检测方法，其特征在于：所述的检测板为检测芯片，该检测芯片内设置有空腔，该空腔依次包括检测窗、腔室连通道和废液池，检测窗上还...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志成，蔡齐勇，叶本晨，潘萌萌，昝明辉，赵少辉，
申请(专利权)人：郑州亮点生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：