蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，且公开了蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用，蛋白交联纳米硅为蛋白与纳米微球偶联物的结合体，所述的蛋白为生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白，所述的蛋白交联纳米亲和微球应用于细胞外囊泡的提取纯化，纳米微球偶联物为链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球。本发明专利技术通过制备的蛋白交联纳米硅可对各种干细胞来源的外泌体提取纯化，而且该方法操作方便，耗时短，提取效率高，获得的外泌体纯度高，产量多，还能保证其生物学活性及完整性，本发明专利技术的方法非常适合外泌体相关的技术开发及转化应用，能够快速且大规模分离样品中的干细胞外泌体，并保证分离后的干细胞外泌体具有较高的纯度。的纯度。

【技术实现步骤摘要】
蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体为蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用。

技术介绍

[0002]外泌体是由活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30
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150nm，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液、腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用开发潜力。
[0003]间充质干细胞来源的外泌体是干细胞分泌产生的细胞外囊泡，可通过选择性的转运蛋白质、mRNA、microRNA来充当间充质干细胞与已分化细胞的信号分子。现有研究已证明间充质干细胞外泌体在减少心肌梗死面积，减轻肢体缺血，增进伤口愈合，改善移植物抗宿主病，减少肾损伤，促进肝再生，促进皮肤细胞再生、减轻视网膜损伤，以及最近改善软骨和骨再生等方面具有重要作用。
[0004]目前超速离心法虽然是公认的外泌体提取的标准方法，但是操作费时费力、高度依赖人工、回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验，密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐、重复性差、耗时很长、回收率低，不适合大批量提取外泌体。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用，具备时间短，操作简单等优点，解决了操作繁琐、重复性差、耗时很长、回收率低，不适合大批量提取外泌体的问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]蛋白交联纳米硅，所述蛋白交联纳米硅为蛋白与纳米微球偶联物的结合体。
[0010]所述蛋白为生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白。
[0011]所述蛋白交联纳米亲和微球应用于细胞外囊泡的提取纯化。
[0012]蛋白交联纳米硅的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S1、将羧酸化纳米硅球加入到DMF中，得到M1。
[0014]S2、向M1中加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球，混合搅拌，再加入亲和液，反应1小时至4小时后离心分离，得到M2。
[0015]S3、对M2进行离心过滤，并将过滤后的沉淀采用盐酸水溶液洗涤，得到纳米硅活性酯。
[0016]S4、将AnnexinV蛋白或Tim4蛋白加入到磷酸缓冲溶液中，再加入上述得到的纳米硅活性酯，搅拌后离心取沉淀，得到沉淀物，将所述沉淀物用洗涤液洗涤，最后加入洗脱液洗脱即得蛋白交联纳米硅。
[0017]优选的，所述羧酸化纳米硅球的直径为300nm至40μm。
[0018]优选的，所述纳米微球偶联物为链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球。
[0019]优选的，所述生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白的制备方法为：将AnnexinV蛋白或Tim4蛋白加入活性生物素，4℃孵育1小时至24小时，再用脱盐柱去除游离的生物素，用PBS缓冲液洗脱，得到生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白。
[0020]蛋白交联纳米硅外泌体分离纯化方法，包括以下步骤：
[0021]取外泌体粗提液，加入蛋白交联的纳米硅，再加入CaCl2混合后，进行离心分离，得到沉淀P1，采用缓冲液洗涤后干燥，得到P2。
[0022]加入洗脱液与P2混合，并静置一段时间后，收集上清液，即得到分离纯化后的干细胞外泌体，所述蛋白交联的纳米硅为AnnexinV蛋白交联的纳米硅时，加入终浓度为15mmol/LCaC12，所述缓冲液为Ca
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HEPES缓冲液，其包括了10mMHEPES、1mMMgCl2、5mMKCl、2％BSA、15mMCaCl2和150mMNaCl，所述HEPES的pH为7.5。
[0023]所述蛋白交联的纳米硅为Tim4蛋白交联的纳米硅时，加入终浓度2mmol/LCaC12，所述缓冲液包括20mMTris
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HCl、150mMNaCl、0.0005％Tween20和2mMCaCl2，所述Tris
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HCl的pH为7.5。
[0024]优选的，所述外泌体为不同来源的干细胞及其诱导分化细胞，包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞，羊膜间充质干细胞、牙髓干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞或胚胎干细胞及其诱导分化细胞的外泌体，还包括植物和动物来源的体液，如血清、血浆、尿液、牛奶、不同来源的细胞，如植物细胞，动物体细胞及干细胞的培养上清液，及富血小板血浆。
[0025]优选的，所述洗脱液包括以下组分：20mM
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30mMTris
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HCl、1mM
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5mMNaCl、5mM
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10mMEDTA、pH7.2
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7.5。
[0026]本专利技术纯化的外泌体的应用，外泌体用外泌体药物装载与应用，外泌体靶向治疗与应用，包括急性呼吸窘迫症，呼吸道感染，哮喘及阿默茨海默症和创面修复及医学美容类应用。
[0027](三)有益效果
[0028]与现有技术相比，本专利技术提供了蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用，具备以下有益效果：
[0029]本专利技术通过制备的蛋白交联纳米硅可对各种干细胞来源的外泌体提取纯化，而且该方法操作方便，耗时短，提取效率高，获得的外泌体纯度高，产量多，还能保证其生物学活性及完整性，本专利技术的方法非常适合外泌体相关的技术开发及转化应用，能够快速且大规模分离样品中的干细胞外泌体，并保证分离后的干细胞外泌体具有较高的纯度。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术
中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]在本专利技术中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本专利技术中的具体含义。
[0032]蛋白交联纳米硅，蛋白交联纳米硅为蛋白与纳米微球偶联物的结合体。
[0033]蛋白为生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白交联纳米硅，其特征在于，所述蛋白交联纳米硅为蛋白与纳米微球偶联物的结合体；所述蛋白为生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白；所述蛋白交联纳米亲和微球应用于细胞外囊泡的提取纯化。2.根据权利要求1所述的蛋白交联纳米硅的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将羧酸化纳米硅球加入到DMF中，得到M1；S2、向M1中加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球，混合搅拌，再加入亲和液，反应1小时至4小时后离心分离，得到M2；S3、对M2进行离心过滤，并将过滤后的沉淀采用盐酸水溶液洗涤，得到纳米硅活性酯；S4、将AnnexinV蛋白或Tim4蛋白加入到磷酸缓冲溶液中，再加入上述得到的纳米硅活性酯，搅拌后离心取沉淀，得到沉淀物，将所述沉淀物用洗涤液洗涤，最后加入洗脱液洗脱即得蛋白交联纳米硅。3.根据权利要求1所述的蛋白交联纳米硅，其特征在于，所述羧酸化纳米硅球的直径为300nm至40μm。4.根据权利要求1所述的蛋白交联纳米硅，其特征在于，所述纳米微球偶联物为链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球。5.根据权利要求1所述的蛋白交联纳米硅，其特征在于，所述生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白的制备方法为：将AnnexinV蛋白或Tim4蛋白加入活性生物素，4℃孵育1小时至24小时，再用脱盐柱去除游离的生物素，用PBS缓冲液洗脱，得到生物素标记的AnnexinV蛋白或Tim4蛋白。6.根据权利要求1
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5任一项所述的蛋白交联纳米硅外泌体分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：取外泌体粗提液，加入蛋白交联的纳米硅，再加入CaCl2混合后，进行离心分离，得到沉淀P1，采用缓冲液洗涤后干燥，得到P2；加入洗脱液与P2混合，并静置一段时间后，收集上清液，即得到分离纯化后的干细胞外泌体，所述蛋白交联的纳米硅为AnnexinV蛋白交联的纳米硅时...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵彬，
申请(专利权)人：赵彬，
类型：发明
国别省市：