氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用制造技术

本申请公开了一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用，具体涉及一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其制备方法，本发明专利技术还公开了所述半抗原在抗体、试剂盒方面的应用。针对氯氰菊酯含量检测半抗原建立的酶联免疫试剂盒能实现快速大批量待检测产品的检测，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于农产品尤其是烟草中氯氰菊酯的现场监控和大量样本的筛查。菊酯的现场监控和大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用


[0001]本申请涉及农药残留检测
，特别是一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用。

技术介绍

[0002]氯氰菊酯(Cypermethrin)是一种高效的广谱杀虫剂，由于其杀虫效率高和效果持久，被经常用于小麦、玉米、水果、蔬菜和烟草等农产品的害虫防治。起初该农药一直被认为是毒性较低、无蓄积性的安全农药，但是近年来研究发现，氯氰菊酯是一类亲脂型化合物，可通过鱼鳃进入水生生物中，对水体系统造成损害；而且该物质对哺乳动物的中枢神经系统、内分泌系统等也存在显著的危害。当环境中存在该物质的残留物时，仍然可能对人体机能造成伤害，因此美国环境保护局将其确定为潜在的内分泌干扰物，而氯氰菊酯引起的环境污染问题和食品安全问题也日益受到重视。我国针对不同作物，制定了对应的氯氰菊酯最大残留限量标准，其中烟草中该物质的最大残留限量为1m/kg。
[0003]目前，现有文献中只出现对谷物、水果、蔬菜中这类杀虫剂残留量的检测报道，而没有见到有关烟叶中残留量的测定方法的报道。国内外对氯氰菊酯残留的现有检测方法主要有气相色谱
‑
质谱联用(GC
‑
MS)、高效液相色谱
‑
质谱联用(HPLC
‑
MS)、气相色谱法(GC)等。
[0004]此类仪器分析方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。
[0005]免疫学检测分析技术以其高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点，已被药物残留检测领域广泛应用，与仪器检测方法相比具有很多优势。但现有技术中缺乏对氯氰菊酯具有特异性反应的检测试剂，阻碍了免疫分析检测法在氯氰菊酯检测中的运用。
[0006]在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测氯氰菊酯时，关键技术在于能够获取特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是需要合成、制备出合适的氯氰菊酯半抗原。
[0007]现有技术中公开了CN202110159937.3氟氯氰菊酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，所公开的半抗原在其抗体交叉反应性测定中，采用间接竞争ELISA方法测定该氟氯氰菊酯单克隆抗体对氯氰菊酯的交叉反应率＜1％。说明该半抗原并不能与氯氰菊酯发生特异性免疫反应，无法用于对氯氰菊酯含量的检测。

技术实现思路

[0008]本申请提供了一种氯氰菊酯含量检测用半抗原及其应用，用于解决现有技术中存在的氯氰菊酯检测方法样本处理繁琐，检测效率低，无法实现快速大批量检测；缺乏针对氯氰菊酯具有特异性的酶联免疫检测半抗原的技术问题。
[0009]本申请提供了一种氯氰菊酯含量检测用半抗原，化学名称为：(E)4
‑
((4
‑
(含氰基的((3
‑
(2,2
‑
二氯乙烯基)2、2
‑
二甲基环丙基甲酰氯)氧)甲基)苯基)二氮烯基
‑3‑
羟基苯甲
酸；化学结构式为：
[0010][0011]所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：
[0012]以氨基苯乙腈为原料经重氮化反应得到反应物，所述反应物与3
‑
羟基苯甲酸进行偶合反应后再与二氯菊酸进行缩合反应，得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
[0013]具有该结构式的半抗原按现有技术中常用方法处理后可制得抗体，该抗体能对经过预处理后的各类农产品样本中所含的氯氰菊酯产生特异性反应。根据该特性可对氯氰菊酯标准品梯度稀释获得不同浓度氯氰菊酯标准品溶液，采用酶标仪在450nm下测量各标准品溶液的OD值得到标准曲线后，对待测样本进行预处理，测定相同波长下的OD值，并通过标准曲线得到对应的浓度，从而实现对样本中所含氯氰菊酯含量的定量有效、快速检测。
[0014]采用该反应能获得纯度较高的半抗原。该制备方法中所用试剂及反应条件，可按现有重氮化、偶合、缩合反应所需的试剂和条件进行选择。
[0015]本申请提供该半抗原制成试剂盒后用于对烟叶中所含氯氰菊酯进行检测时，样本灵敏度为9μg/L，说明该半抗原制成试剂盒后，对氯氰菊酯的检测灵敏度较高；按现有方法制成试剂盒后，对烟叶样本中的氯氰菊酯的检测限为900μg/kg，满足氯氰菊酯的国标检出限要求，可以用于对烟草样本中所含氯氰菊酯含量的有效检测；该半抗原制成试剂盒后，对烟叶样本中的氯氰菊酯的回收率为100％
±
20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％，具有显著特异性，能满足检测需要。
[0016]所得半抗原制成试剂盒后，对其他具有类似结构的农药的交叉反应性均小于1％，对氯氰菊酯则可达100％，说明该半抗原可特异性地检出氯氰菊酯并避免其他类似结构农药对检测结果的干扰。能很好地填补现有技术中缺乏针对氯氰菊酯具有明显特异性的半抗原。
[0017]优选的，所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：
[0018]1)加乙醇溶解氨基苯乙腈后，加入强酸溶液和水充分搅拌后，冷却到0～5℃，加入亚硝酸钠水溶液搅拌1h，得到原料液；
[0019]2)加氢氧化钠水溶液溶解3
‑
羟基苯甲酸，加入水充分搅拌后，冷却到0～5℃，滴加全部所述原料液，保持0～5℃下反应4h后停止反应，对所得溶液进行分离纯化，得到中间产物；
[0020]3)溶解二氯菊酸后加入三氯甲烷，冷却至0～5℃，再加入草酰氯搅拌2h，加入全部中间产物并继续搅拌1h，恢复至室温，继续搅拌2h后停止反应，加入水并补加三氯甲烷，得到反应液；
[0021]4)对所得反应液进行分离纯化得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。
[0022]本申请半抗原制备方法的反应方程式如式(2)所示：
[0023][0024]由上可知，该反应可以正常发生，并制得具有上述结构的半抗原。
[0025]具有该结构式的半抗原按现有技术中常用方法处理后可制得抗体，该抗体能对经过预处理后的各类农产品样本中所含的氯氰菊酯产生特异性反应。
[0026]根据该特性可对氯氰菊酯标准品梯度稀释获得不同浓度氯氰菊酯标准品溶液，采用酶标仪在450nm下测量各标准品溶液的OD值得到氯氰菊酯标准曲线。对具体样本进行检测时，对待测样本进行预处理，采用包括上述半抗原的试剂盒对处理后样本，采用酶标仪在450nm波长处测定相同OD值，并通过标准曲线得到对应的浓度，从而实现对样本中所含氯氰菊酯含量的定量有效、快速检测。
[0027]例如对于待测样本的预处理，以烟叶为例，具体包括以下步骤：将烟叶样本捣碎，称取1.0g
±
0.05g捣碎的样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL乙腈，用涡旋混合仪涡动3min，混匀，3000
×
g室温(20～25℃)离心5min；移取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氯氰菊酯含量检测用半抗原，其特征在于，化学名称为：(E)4
‑
((4
‑
(含氰基的((3
‑
(2,2
‑
二氯乙烯基)2、2
‑
二甲基环丙基甲酰氯)氧)甲基)苯基)二氮烯基
‑3‑
羟基苯甲酸；化学结构式为：所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：以氨基苯乙腈为原料经重氮化反应得到反应物，所述反应物与3
‑
羟基苯甲酸进行偶合反应后再与二氯菊酸进行缩合反应，得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。2.根据权利要求1所述的氯氰菊酯含量检测用半抗原，其特征在于，所述氯氰菊酯含量检测用半抗原的制备方法包括以下步骤：1)加乙醇溶解氨基苯乙腈后，加入强酸溶液和水充分搅拌后，冷却到0～5℃，加入亚硝酸钠水溶液搅拌1h，得到原料液；2)加氢氧化钠水溶液溶解3
‑
羟基苯甲酸，加入水充分搅拌后，冷却到0～5℃，滴加全部所述原料液，保持0～5℃下反应4h后停止反应，对所得溶液进行分离纯化，得到中间产物；3)溶解二氯菊酸后加入三氯甲烷，冷却至0～5℃，再加入草酰氯搅拌2h，加入全部中间产物并继续搅拌1h，恢复至室温，继续搅拌2h后停止反应，加入水并补加三氯甲烷，得到反应液；4)对所得反应液进行分离纯化得到所述氯氰菊酯含量检测用半抗原。3.根据权利要求2所述的氯氰菊酯含量检测用半抗原，其特征在于，所述步骤1)中所述强酸溶液为1mol/L的HCl溶液；优选地，所述步骤2)中分离纯化操作包括以下步骤：用酸溶液调节pH值到6，以乙酸乙酯为溶剂萃取三次后合并所得有机相，旋蒸蒸干，用体积比为10:1的1,2
‑
二氯乙烷
‑
正己烷混合溶液重结晶，得到所述中间产物；优选地，所述步骤2)中所用酸溶液为6mol/L HCl溶液；每次萃取所用溶剂的体积为100mL；优选地，所述步骤4)中所述分离纯化操作包括以下步骤：对所得反应液充分震荡，静置，分去水相，水洗有机相加100mL水充分震荡，静置，分去水相，浓缩蒸干，上硅胶柱，用体积比为10:1的二氯甲烷
‑
甲醇混合溶液洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春琼，李超，陈丹，孙浩巍，张轲，张晓伟，叶灵，蔡洁云，徐安传，秦世春，龙杰，曾彦波，张燕，杨艺敏，张庆刚，
申请(专利权)人：云南省烟草质量监督检测站，
类型：发明
国别省市：