一种胰腺癌相关基因甲基化检测的方法，试剂盒及应用技术

本发明专利技术公开了一种胰腺癌相关基因甲基化的检测方法及试剂盒。本发明专利技术通过设计和制备特异性甲基化检测的引物和探针扩增经重硫酸盐转化纯化的Bis DNA，结合科学合理的实时荧光PCR反应体系优化，根据ADAMTS1基因、BNC1基因与ACTB基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待测样本的平均甲基化值，实现区分早期胰腺癌患者，存在潜在胰腺癌风险的患者和非胰腺癌患者的早诊早治目的。本发明专利技术的试剂盒对早期胰腺癌患者检出率高达100%，特异性为100%，不仅可以避免患者反复筛查和盲目用药，而且可以显著降低不必要的临床费用，为病患和社会带来临床检测效益。检测效益。检测效益。

【技术实现步骤摘要】
一种胰腺癌相关基因甲基化检测的方法，试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及到一种胰腺癌相关基因甲基化检测的方法，试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]胰腺癌被称为“癌症之王”，是一种严重危害人们生命的恶性肿瘤。由于大部分患者在胰腺癌晚期才出现症状，造成其治疗效果不佳，生存率非常低，所以非常有必要开发用于胰腺癌早期诊断的辅助筛查手段。
[0003]多年来的研究表明，胰腺癌既是一种DNA突变的疾病，也是一种表观遗传学失调的疾病。可见，基因突变和DNA启动子甲基化模式的改变在胰腺癌发生和进展中可能起到了关键作用。虽然许多研究已经使用特定基因突变和甲基化分析对多种癌症进行诊断，但是目前市场上仍然缺乏高灵敏度和高特异性的用于筛查胰腺癌早期患者的相关检测技术及产品。
[0004]综上所述，鉴于现有技术存在的缺陷和不足之处，本专利技术建立了一种胰腺癌相关基因甲基化检测的方法，同时提供了一种灵敏度好且价格低廉的可用于早期筛查胰腺癌高危人群的试剂盒。本专利技术所述的检测方法和试剂盒可以辅助医生识别和区分胰腺癌早期患者，存在潜在的胰腺癌风险的患者及非胰腺癌患者，有助于改善胰腺癌患者的早诊早治情况，从而可以大大提高胰腺癌患者预后生存率，给社会和病患带来检测收益。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术通过设计特异性高的引物及探针，结合科学合理的实时荧光PCR反应体系，仅通过对ADAMTS1和BNC1两个基因甲基化的检测实现了对胰腺癌患者的早诊早治，且能区分胰腺癌早期患者，存在潜在的胰腺癌风险的患者及非胰腺癌患者，检出率高达100%，特异性为100%，不仅可以避免患者反复筛查和盲目用药，而且可以显著降低不必要的临床费用，为病患和社会带来临床检测效益。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种胰腺癌相关基因甲基化检测方法，所述检测方法包括以下步骤：第一步，从患者血液或组织中提取DNA样本；第二步，将第一步提取得到的DNA样本进行重硫酸盐转化反应后纯化得到Bis DNA；第三步，采用PCR扩增液对将第二步获得的Bis DNA进行探针荧光定量PCR扩增，所述PCR 扩增液包括：ADAMTS1正向引物、ADAMTS1反向引物、ADAMTS1检测探针、BNC1正向引物、BNC1反向引物、BNC1检测探针、ACTB正向引物、ACTB 反向引物、ACTB检测探针、脱氧核糖核苷三磷酸和无核酸酶水；第四步，根据第三步获得的探针荧光定量PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定患者DNA样本的甲基化值。优选地，早期胰腺癌患者的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化值的平均值大于15，非胰腺癌患者的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB基因甲基化值的平均值小于0.5。如果患者DNA样本的甲基化值在0.5
‑
15之间（包括0.5和15），说明患者存在发展成胰腺癌的风险，建议定期复查，以免
病情恶化。
[0007]在本专利技术中，在ADAMTS1基因、BNC1基因和内标基因ACTB(b
‑
actin)的启动子区分别设计一对特异性的甲基化检测的引物及探针，然后用设计的引物及探针去扩增经重硫酸盐转化的样本DNA，根据ADAMTS1基因、BNC1基因与ACTB基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待测样本的甲基化值，根据甲基化值来评判胰腺癌变的风险。ADAMTS1和BNC1两个基因甲基化检测的相互结合，让胰腺癌早诊早筛检测具有快速、灵敏度和特异性高等优点。
[0008]进一步地，所述胰腺癌相关基因甲基化的检测方法，其步骤中第一步的DNA样本的提取具体包括以下步骤：先将患者血液或组织消化液离心后移除上清液，随后在所获得的血浆或组织提取物样本中依次加入缓冲液和蛋白酶K进行混匀和温育，然后再加入磁珠混匀和旋转孵育，得到样本DNA。
[0009]优选地，所述离心的时间为1
‑
20分钟。在一些实施例中，离心的时间为2分钟。在一些实施例中，离心的时间为3分钟。在一些实施例中，离心的时间为4分钟。在一些实施例中，离心的时间为5分钟。在一些实施例中，离心的时间为6分钟。在一些实施例中，离心的时间为7分钟。在一些实施例中，离心的时间为8分钟。在一些实施例中，离心的时间为9分钟。在一些实施例中，离心的时间为10分钟。在一些实施例中，离心的时间为12分钟。在一些实施例中，离心的时间为14分钟。在一些实施例中，离心的时间为16分钟。在一些实施例中，离心的时间为18分钟。
[0010]优选地，所述离心的转速为2500
‑
15000rpm。在一些实施例中，离心的转速为2700rpm。在一些实施例中，离心的转速为3000rpm。在一些实施例中，离心的转速为3300rpm。在一些实施例中，离心的转速为3600rpm。在一些实施例中，离心的转速为3800rpm。在一些实施例中，离心的转速为4100rpm。在一些实施例中，离心的转速为4400rpm。在一些实施例中，离心的转速为4700rpm。在一些实施例中，离心的转速为6000rpm。在一些实施例中，离心的转速为6500rpm。在一些实施例中，离心的转速为7000rpm。在一些实施例中，离心的转速为7500rpm。在一些实施例中，离心的转速为8000rpm。在一些实施例中，离心的转速为9000rpm。在一些实施例中，离心的转速为10000rpm。在一些实施例中，离心的转速为11000rpm。在一些实施例中，离心的转速为12000rpm。在一些实施例中，离心的转速为13000rpm。在一些实施例中，离心的转速为14000rpm。
[0011]优选地，所述血浆或组织提取物样本、蛋白酶K和磁珠的体积比为（140
‑
120）:（3
‑
1）:（2
‑
0.5）。在一些实施例中，所述所述血浆或组织提取物样本、蛋白酶K和磁珠的体积比的体积比为138:2.9:1.8。在一些实施例中，所述所述血浆或组织提取物样本、蛋白酶K和磁珠的体积比、蛋白酶K和磁珠的体积比为135:2.7:1.6。在一些实施例中，所述所述血浆或组织提取物样本、蛋白酶K和磁珠的体积比、蛋白酶K和磁珠的体积比为133:2.6:1.5。在一些实施例中，所述所述血浆或组织提取物样本、蛋白酶K和磁珠的体积比、蛋白酶K和磁珠的体积比为133:2.4:1.2。在一些实施例中，所述所述血浆或组织提取物样本、蛋白酶K和磁珠的体积比为130:2.2:1。在一些实施例中，所述所述血浆或组织提取物样本、蛋白酶K和磁珠的体积比为127:2:0.8。在一些实施例中，所述血浆或组织提取物、蛋白酶K和磁珠的体积比为125:1.8:0.7。在一些实施例中，所述血浆或组织提取物、蛋白酶K和磁珠的体积比为123:1.5:1。在一些实施例中，所述血浆或组织提取物、蛋白酶K和磁珠的体积比为121:1.2:1。
[0012]优选地，所述温育的时间为7
‑
15分钟。在一些实施例中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胰腺癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤： 第一步，从患者血液或组织中提取DNA样本；第二步，将第一步提取得到的DNA样本进行重硫酸盐转化反应，然后纯化得到Bis DNA；第三步，采用PCR扩增液对将第二步获得的产物进行探针荧光定量PCR扩增，所述PCR 扩增液包括：ADAMTS1正向引物、ADAMTS1反向引物、ADAMTS1检测探针、BNC1正向引物、BNC1反向引物、BNC1检测探针、ACTB正向引物、ACTB 反向引物、ACTB检测探针、脱氧核糖核苷三磷酸和无核酸酶水；第四步，根据第三步获得的探针荧光定量PCR扩增的结果确定患者DNA样本的甲基化值，当患者DNA样本中的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化值的平均值大于一定值时，为早期胰腺癌患者；当患者DNA样本中的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化值的平均值小于一定值时，为非胰腺癌患者；当患者DNA样本中的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化值的平均值介于早期胰腺癌患者和非胰腺癌患者甲基化值平均值之间，说明患者存在潜在的胰腺癌风险，需要定期检测ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化值变化，避免病情恶化。2.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述步骤中第一步的DNA样本的提取具体包括以下步骤：先将血液离心后移除上清液，随后在所获得的血浆样本中依次加入缓冲液和蛋白酶K进行混匀和温育，然后再加入磁珠混匀和旋转孵育，得到样本DNA；所述离心的时间为1
‑
20分钟；所述离心的转速为2500
‑
15000rpm；所述血浆样本、蛋白酶K和磁珠的体积比为（140
‑
120）:（3
‑
1）:（2
‑
0.5）；所述温育的时间为7
‑
15分钟，所述温育的温度为55
‑
65摄氏度；所述旋转孵育的时间为5
‑
15分钟；所述旋转孵育的温度为20
‑
30摄氏度。3.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述步骤中第二步的重硫酸盐的转化反应具体包括以下步骤：先将第一步提取得到的DNA样本、亚硫酸氢钠溶液、DNA凝胶加样缓冲液和水混合，随后升温至75
‑
90摄氏度反应5
‑
10分钟，然后降温至40
‑
55摄氏度反应1.5
‑
2.5小时，最后在5
‑
15摄氏度保持2
‑
4小时；所述DNA样本、亚硫酸氢钠溶液、DNA凝胶加样缓冲液和水的体积比为1:(75
‑
85):(25
‑
30):1；所述亚硫酸氢钠溶液的质量浓度为35
‑
45wt％。4.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述步骤中第三步的探针荧光定量PCR的扩增具体包括以下步骤：先将第二步重硫酸盐转化反应得到的反应液倒入UNIQ
‑
10柱，随后依次通过缓冲液洗涤、脱磺化液脱磺化，然后用洗脱液进行洗脱，最后获得纯化的Bis DNA；所述缓冲液的组成为三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、乙二胺四乙酸钠、乙醇和双蒸水；所述磺化液的组成为三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氢氧化钠、乙醇和双蒸水。5.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述步骤中第三步中ADAMTS1正向引物的序列为5
´‑
TTAGGGAGTTGAGTAAGAC
‑3´
，所述ADAMTS1反向引物的序列为5
´‑
TAAAATAAGCTATAAATAACTAAACG
‑3´
，所述ADAMTS1检测探针的序列为5
´‑ꢀ
AGATAAAACGCGACGCGGGGTTAG
‑3´
。6.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述步骤中第三步中BNC1正向引物的序列为5
´‑
TTAGGAGGTAAAGATTGATGT
‑3´
，所述BNC1反向引物的序列为5
´‑
CCAATAACAATAAATCCCTAAACAA
‑3´
，所述BNC1检测探针的序列为5
´‑ꢀ
AGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：童云广，张竞闻，
申请(专利权)人：杭州奥明医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：