用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点、检测试剂盒及用途制造技术

本发明专利技术公开了用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点、检测试剂盒及用途。本发明专利技术提供了用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点，采用这些甲基化CpG位点中的任意一种或两种以上的组合作为生物标志物，通过检测患者外周血白细胞中甲基化CpG位点的甲基化水平，从而预测胃癌化疗疗效。本发明专利技术还提供了基于这些甲基化CpG位点、其扩增引物和接头引物等设计的用于预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒和系统，通过该检测试剂和系统能够有效的对相应甲基化CpG位点的甲基化水平进行检测，从而预测胃癌化疗疗效，为胃癌患者个体化治疗提供新的思路和方法。法。

【技术实现步骤摘要】
用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点、检测试剂盒及用途


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，特别涉及用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点、检测试剂盒及用途。

技术介绍

[0002]胃癌(gastric cancer，GC)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是全世界最常见的恶性肿瘤之一。由于巨大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前胃癌的早期诊断率仍较低，超过80％的胃癌患者确诊时已处于进展期，临床预后差，5年生存率低于20％，使得胃癌的死亡率很高。
[0003]由于胃癌的患病部位比较特殊，因此，目前药物治疗是胃癌患者的主要治疗手段。目前胃癌的主要化疗药物包括氟尿嘧啶类、铂类和紫杉类药物，通常以氟尿嘧啶类药物(5
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FU/卡培他滨/替吉奥/雷替曲塞)为基础，联合铂类(奥沙利铂/顺铂/洛铂)和/或紫杉类(多西他赛/紫杉醇)组成两药或三药方案。但在化疗药物治疗过程，常常由于获得耐药性而导致治疗失败。因此，如何改善胃癌患者治疗的疗效和长期预后，提高患者的生存率和生活质量是亟待解决的问题。
[0004]长链非编码RNA(long non
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coding RNA，LncRNA)是指长度超过200个核苷酸的在众多功能上如可变剪接，染色质重构以及RNA代谢等方面具有相关性但没有编码蛋白能力的调节的RNA。近年来，LncRNA作为一类新型、有效的致癌调节因子，已成为研究热点。已有研究表明，LncRNA参与了多种肿瘤的形成过程，LncRNA的表达与胃癌的发生发展、治疗及预后有关。
[0005]表观遗传是指由非DNA序列改变引起的、可遗传的基因表达水平的改变。表观遗传的主要形式包括DNA甲基化、RNA干扰、组蛋白修饰和染色质重塑等。表观遗传通过调控基因表达参与发育编程，如早期发育重编程、基因组印记、X染色体失活和组织分化等事件。近年来，表观遗传因素在癌症中的作用已被证实。DNA甲基化作为表观遗传的主要机制，在胃癌的发生、发展及预后中发挥着重要的作用。DNA甲基化模式是组织和细胞特有的，是由DNA甲基转移酶介导的一种共价修饰，通过S
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腺苷甲硫氨酸将甲基添加到基因组中的胞嘧啶上，主要发生在胞嘧啶
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鸟嘌呤(CpG)二核苷酸上，是哺乳动物DNA的一种可遗传的、组织和物种特异性修饰。多项研究报道在癌症进展和患者预后期间，LncRNA对DNA甲基化的调控作用是控制基因表达的重要机制。此外，众多研究表明，DNA甲基化与年龄、吸烟、饮酒等环境因素之间存在交互作用，而且这些与环境因素间的交互作用与肿瘤的发生发展相关。
[0006]转移相关肺腺癌转录本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1)基因，最初是在研究人非小细胞肺癌的转移中通过减除杂交法筛选鉴定出的一个新的长链非编码RNA，定位于人类11q13染色体上，其在序列上进化保守，种属间具有高度同源的序列，提示其在肿瘤的发生发展和转移的过程中发挥着重要功能。H19基因是一个在人类和其它动物中发现的LncRNA基因，H19印迹基因位于人染色体11P15.5及鼠
的7号染色体上，属于单拷贝基因，受位于H19基因上游4kb处的差异甲基化区域(differentially methylated region，DMR)调控，基因印迹的分子基础可能是DNA在胚胎发育的早期阶段的甲基化和染色质结构的变化。研究显示，H19作为LncRNA能使许多与肿瘤细胞的侵袭、迁移及血管形成密切相关的基因表达上调，在一些癌症如乳腺癌、膀胱癌和胃癌中上调并扮演重要角色，并且H19的表达情况与术后早期复发现象有明显的关系，可作为判断术后早期复发的检测指标。
[0007]胃癌通常具有明确的发生部位和病变组织，因此，癌组织是进行胃癌相关研究时常用的标本。但是组织标本在取样时存在困难和阻碍，不仅成本高，而且研究对象依从性较差，因此并不适用于广泛的人群筛查和癌症的早期诊断。非侵入性生物样本(血液、唾液、尿液和乳汁等)中含有大量的分析物，尤其是外周血液来源的生物标志物，具有取样方便快速、微创、需求量少，可有效地提高研究对象的依从性等优点，为癌症早期识别和诊断治疗提供了新的途径。
[0008]目前已有多项研究表明MALAT1和H19基因在胃癌发生发展中发挥重要的作用，这些LncRNA可能影响DNA甲基化进而影响药物的作用，导致胃癌治疗结局在不同个体之间的差异。因此，本专利技术致力于阐明用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点、检测试剂盒及用途。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术有必要提供用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点，这些甲基化CpG位点源自外周血白细胞MALAT1和/或H19基因，通过检测这些甲基化CpG位点的甲基化水平能够有效的预测胃癌化疗疗效，为指导胃癌患者个体化治疗提供新的思路和方法。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]本专利技术提供了用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点，所述甲基化CpG位点源自目标基因H19和/或MALAT1，所述甲基化CpG位点选自以下所述的甲基化CpG位点中的任何一种或两种以上的组合作为生物标志物：chr11:2018130、chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018082、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263453、chr11:65263469、chr11:65265002、chr11:65264972。
[0012]通过检测上述甲基化CpG位点的甲基化水平能够预测胃癌化疗疗效，具体的说，chr11:2018130、chr11:2018082、chr11:65263453、chr11:65264972位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263469、chr11:65265002位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好。
[0013]并且上述甲基化CpG位点通过采集患者的外周血白细胞即可进行检测，具有快速、简便、有效和准确度高的优势。
[0014]本专利技术进一步提供了一种检测甲基化CpG位点的甲基化水平的试剂在制备预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒中的用途，所述甲基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点，其特征在于，所述甲基化CpG位点源自目标基因H19和/或MALAT1，所述甲基化CpG位点选自以下所述的甲基化CpG位点中的任何一种或两种以上的组合作为生物标志物：chr11:2018130、chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018082、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263453、chr11:65263469、chr11:65265002、chr11:65264972。2.一种检测甲基化CpG位点的甲基化水平的试剂在制备预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述甲基化CpG位点源自目标基因H19和/或MALAT1，所述甲基化CpG位点选自以下所述的甲基化CpG位点中的任何一种或两种以上的组合作为生物标志物：chr11:2018130、chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018082、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263453、chr11:65263469、chr11:65265002、chr11:65264972。3.如权利要求2所述的检测甲基化CpG位点的甲基化水平的试剂在制备预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒中的用途，其特征在于，检测所述甲基化CpG位点的的甲基化水平的方法包括以下步骤：获取胃癌患者的外周血作为待测样品，提取外周血白细胞中的DNA；重亚硫酸盐转化提取的DNA样本，目标片段多重PCR扩增反应；在样本中添加特异性标签序列；定量后上机测序；根据测序数据生物信息学分析确定所述甲基化CpG位点的甲基化水平。4.如权利要求3所述的检测甲基化CpG位点的甲基化水平的试剂在制备预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述的特异性标签序列由ATCACG、CGATGT、TTAGGC、TGACCA、ACAGTG、GCCAAT、CAGATC、ACTTGA、GATCAG、TAGCTT、GGCTAC和CTTGTA组成。5.用于预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括用于检测甲基化CpG位点的甲基化水平的试剂，其中，所述甲基化CpG位点源自目标基因H19和/或MALAT1，所述甲基化CpG位点选自以下所述的甲基化CpG位点中的任何一种或两种以上的组合作为生物标志物：chr11:2018130、chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018082、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263453、chr11:65263469、chr11:65265002、chr11:65264972。6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括用于扩增所述甲基化CpG位点的引物和测序文库构建的接头引物。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，邹延峰，胡定涛，滕影，宗启群，胡皖琴，
申请(专利权)人：安徽医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：