一种食品致敏原检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于微针贴片和纳米酶的食品致敏原快速检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括：可特异性快速提取食品中致敏原蛋白的微针贴片，具有高灵敏度、信号放大功能的试剂A，用于显色的试剂B，标准蛋白溶液，琼脂粉和洗液。修饰有特异性核酸适配体的微针贴片可快速特异性地提取食品中的目标致敏原蛋白，实现快速的样品前处理；试剂A具有催化试剂B显色的作用，有助于提升检测的灵敏度。本发明专利技术所述试剂盒灵敏度高、特异性好，检测速度快，有效解决了传统方法前处理复杂、操作人员专业度要求高及设备依赖度高等问题，且成本远低于抗体类的传统试剂盒，易保存，符合安全要求，适合工业化生产，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种食品致敏原检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于食品致敏原检测
，具体涉及一种基于微针贴片和纳米酶的食品致敏原快速检测试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]食物过敏已经成为一个全球广泛关注的公共卫生问题。目前，食品中致敏原的定量分析方法主要有酶联免疫吸附法、聚合酶链式反应法以及质谱法等。然而，这些方法均存在前处理复杂、检测流程耗时费力等缺点，限制了其在致敏原快速现场筛查方面的应用。比如，市售致敏原ELISA快速检测试剂盒前处理时间可长达约30 min，涉及酶解、离心及抽提等繁琐的样品处理步骤，耗时费力。因此，开发一种前处理简单的致敏原快速定量方法对实现致敏原的快速现场筛查尤为重要。
[0003]微针贴片是一种微米级针状突出物阵列排布而成的贴片材料。研究表明，水凝胶类微针贴片具有较强的从生物组织中提取标志物的能力，其原理在于微针溶胀驱动的毛细管流使目标分子聚集在微针尖端周围。国内外文献报道显示，利用微针贴片的溶胀能力可成功由植物叶片提取病原体DNA，用于植物病害的快速诊断；在免疫分析领域，微针贴片能够提取皮肤间质液用于蛋白质类生物标志物的超灵敏定量研究。微针的出现使得食品样品在未经复杂前处理的情况下用于现场快速致敏蛋白检测成为可能。然而，现有的微针贴片存在蛋白质特异性提取能力差等问题，限制了微针贴片的广泛应用。因此研究具有特异性提取能力的微针贴片是扩大其应用范围的重要方向。
[0004]适配体是一种与靶标有强亲和力且可以特异性结合的核苷酸单链，可以通过碱基互补配对作用、氢键作用以及范德华力等作用力折叠成明确的三维结构，通过空间构型互补与目标分子进行特异性结合。将适配体共价修饰到微针贴片上，可为其特异性提取目标蛋白质提供可能。
[0005]纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又具有催化功能的人工模拟酶。自2007年发现磁性Fe3O4纳米材料具有类辣根过氧化物酶催化活性以来，纳米酶已成为分析传感、生物医学、环境修复等领域的研究热点。金属（单金属及合金）纳米材料、碳纳米管、石墨烯及其衍生物、铈氧化物、钒氧化物、钴氧化物等一系列纳米材料被发现具有类酶活性。与天然酶相比，纳米酶具有灵敏度高、稳定性好等优点，在分析传感领域，其优异的信号放大效应可用于提高检测系统的灵敏度。
[0006]基于以上对微针贴片、核酸适配体及纳米酶的介绍，利用微针贴片的蛋白质快速提取性能和纳米酶信号放大效应，开发食品致敏原快速检测试剂盒，可有效突破传统方法前处理繁琐复杂的瓶颈，为致敏原的快速现场筛查提供新思路。

技术实现思路

本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种基于微针贴片和纳米酶的食品致敏原快速检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括：可特异性快速提
取食品中致敏原蛋白的微针贴片，具有高灵敏度的信号放大功能的试剂A，用于显色的试剂B，标准蛋白溶液，琼脂粉和洗液。其中，试剂A指的是共价修饰有适配体互补序列的纳米酶溶液，试剂B指的是在过氧化物酶或类过氧化物酶存在的情况下，可与过氧化物发生氧化还原反应的显色底物溶液。首先，修饰有特异性核酸适配体的微针贴片可快速特异性地提取食品中的目标致敏原蛋白，实现快速的样品前处理；其次，试剂A中的纳米酶表面修饰有与适配体碱基互补配对的互补序列，可有效结合微针中未与蛋白结合的空余适配体，进一步利用纳米酶能够催化底物试剂B显色的能力，提升检测灵敏度。通过适配体与互补序列的特异性结合，该试剂盒可以定量检测样品中致敏原的含量，不仅灵敏度高、特异性好、检测速度快，还有效解决了传统方法前处理复杂及专业人员依赖度高等问题。
[0007]为解决上述技术难题，本专利技术采用以下技术方案：所述试剂盒包括：微针贴片，试剂A，用于显色的试剂B，标准蛋白溶液，琼脂粉和洗液。
[0008]作为优选方案，所述试剂A可以由任意一种具有类过氧化物酶活性的纳米酶溶液，如金属氧化物，金属纳米颗粒以及金属有机框架等，通过化学共价修饰互补核酸序列制成的；所述互补序列添加浓度为0.5 μmol/每g纳米酶；作为优选方案，所述试剂B可以是任意一种在过氧化物酶或类过氧化物酶存在的情况下，可与过氧化物发生氧化还原反应的显色底物溶液；作为优选方案，所述标准蛋白溶液可以是任意一种纯度不小于90%的致敏原标准蛋白；作为优选方案，所述洗液可以是超纯水，pH=5.7
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8.0磷酸缓冲液，pH=8.6
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10.6甘氨酸缓冲液中的任意一种或几种；作为优选方案，所述微针贴片制备包括以下步骤：（a）通过化学方法在壳聚糖（Cs）的氨基上修饰带有羧基的适配体（Apt），并与一定浓度的聚乙烯醇溶液（PVA）、交联剂混合制成针体制作液；（b）利用具有微孔结构的高分子模板，将针体制作液倒入模板中，通过正压与真空工艺，除去气泡并使针体制作液完全填充微针针尖腔室；（c）待其充分干燥，从模具上小心剥离，即可得到所述可特异性快速提取食品中致敏原的微针贴片；作为优选方案，所述（a）步骤中的壳聚糖脱乙酰度不小于95%，粘度在100
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200 mPa.s范围内，壳聚糖浓度为1 wt%；所述适配体添加浓度为0.05 μmol/每g壳聚糖；作为优选方案，所述（a）步骤中的聚乙烯醇应选取醇解度在98
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99%(mol/mol)范围内，聚乙烯醇浓度为15
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18 wt%；聚乙烯醇和壳聚糖的质量比在1:1
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9:1范围内；作为优选方案，所述（a）步骤中的交联剂是戊二醛，浓度在0.2
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0.5 v/v%的范围内；作为优选方案，所述高分子模板为聚二甲基硅氧烷材料；作为优选方案，所述真空干燥箱中真空条件为0.02 MPa；试剂盒使用方法：（a）将负载适配体的微针贴片扎入食品若干分钟后从食品表面剥离，用试剂盒中的洗液冲洗微针3次以上；
（b）将上述微针浸泡在试剂盒中的试剂A若干分钟后取出微针，并用试剂盒中的洗液冲洗3次以上；（c）将上述微针浸泡在试剂盒中的试剂B，若干分钟后进行吸光值的测定，并与试剂盒中用标准蛋白制备成含一定浓度蛋白的琼脂凝胶得到的标准曲线对应，计算得到样品中的蛋白浓度。
[0009]作为优选方案，采用16.67 mg/mL 1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、13.33 mg/mL N
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羟基琥珀酰亚胺催化使适配体共价修饰到壳聚糖上；作为优选方案，所述催化剂浓度为1.5 mg/mL 1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、2 mg/mL N
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羟基琥珀酰亚胺；作为优选方案，所述用于建立标准曲线的标准蛋白所选浓度为1，10，100，500，1000 ppm；作为优选方案，所述用于建立标准曲线的标准蛋白琼脂凝胶琼脂含量为0.5 wt%。
[0010]与现有技术相比，采用本方法制备的试剂盒，具有如下优点：1、本专利技术的试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：微针贴片、具有高灵敏度的信号放大功能的试剂A、用于显色的试剂B、标准蛋白溶液、琼脂粉和洗液。2.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂A由任意一种具有类过氧化物酶活性的纳米酶溶液，通过修饰互补核酸序列制成。3.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂B是任意一种在过氧化物酶或类过氧化物酶存在的情况下，与过氧化物发生反应的显色底物溶液。4.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述标准蛋白溶液是任意一种纯度不小于90%的致敏原标准蛋白。5.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述洗液是超纯水，pH=5.7
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8.0的磷酸缓冲液，pH=8.6
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10.6的甘氨酸缓冲液中的任意一种或几种。6.根据权利要求1中所述的微针贴片的制备方法，其特征在于：所述制备包括以下步骤：通过在壳聚糖（Cs）的氨基上修饰带有羧基的适配体（Apt），并与聚乙烯醇溶液（PVA）、交联剂混合制成针体制作液；利用具有微孔结构的高分子模板，将针体制作液倒入模板中，通过正压与真空工艺，除去气泡并使针体制作液完全填充微针针尖腔室；待其充分干燥，从模具上小心剥离，即可得到所述可特异性快速提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅玲琳，王彦波，李欢，周瑾茹，冯洁斯，李天舒，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：