能够抑制外泌体中的遗传功能的复合物以及癌症增殖和/或转移抑制剂制造技术

本发明专利技术提供一种缀合物，其包含靶向外泌体表面抗原的抗体或抗体片段，以及基因或其表达产物的抑制剂，其中抗体或抗体片段和基因或其表达产物的抑制剂直接或经由连接基团共价结合或非共价结合。合或非共价结合。合或非共价结合。

【技术实现步骤摘要】
能够抑制外泌体中的遗传功能的复合物以及癌症增殖和/或转移抑制剂
[0001]本申请是基于申请号201780023824.2、申请日2017年2月17日、专利技术名称“能够抑制外泌体中的遗传功能的复合物以及癌症增殖和/或转移抑制剂”的中国专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及能够抑制外泌体的遗传功能的缀合物、以及癌症增殖和/或转移抑制剂。

技术介绍

[0003]最近的研究发现了一种机制，其中包括T细胞、血小板、上皮细胞、免疫细胞或癌细胞的各种细胞释放具有40至100nm直径的称为外泌体的囊泡，从而将信息传递给远处细胞。具体地，已经提出了一种新的机制，其中癌细胞增殖和转移能力由包含在血液中分泌的外泌体中的基因(例如miRNA)的表达产物支配，并且该机制已经引起了极大的关注。
[0004]为了抑制在外泌体中的miRNA的功能，通常使用采用具有与miRNA互补的序列的修饰核酸(反义核酸)的方法(非专利文献1至3)。然而，由于血液中的miRNA被包封在外泌体中，因此即使通过向血液中施用反义核酸也难以直接靶向miRNA。
[0005]使用外泌体作为药物递送系统的许多方法是已知的(非专利文献3至5，以及专利文献1和2)。引文列表专利文献
[0006]专利文献1：JP2010
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285426A专利文献2：JP2014
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185090A非专利文献
[0007]非专利文献1：G.Hutvagner,M.J.Simard,C.C.Mello and P.D.Zamore,PLoS Biol.,2004,2,E98。非专利文献2：U.A.Orom,S.Kauppinen and A.H.Lund,Gene,2006,372,137
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141非专利文献3：S.Davis,B.Lollo,S,Freier and C.Esau,Nucleic Acids Res.,2006,34,2294
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2304非专利文献4：Lai CP,Mardini O,Ericsson M,Prabhakar S,Maguire CA,Chen JW,et al.Acs Nano.2014；8(1):483
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94非专利文献5：Smyth T,Petrova K,Payton NM,Persaud I,Redzic JS,Graner MW,et al.Bioconjugate Chem.2014；25(10):1777
‑
84。

技术实现思路

技术问题
[0008]本专利技术的主要目的是提供一种抑制外泌体中所含的基因(如miRNA)或其表达产物的功能的新方法。技术手段
[0009]本专利技术提供以下缀合物和/或癌症增殖和/或转移抑制剂。项1.一种缀合物，其包含靶向外泌体表面抗原的抗体或抗体片段，以及基因或其表达产物的抑制剂，其中抗体或抗体片段和基因或其表达产物的抑制剂直接或经由连接基团共价结合或非共价结合。项2.根据项1所述的缀合物，其中，外泌体表面抗原是CD9、CD63、CD81或CD147。项3.根据项1或2所述的缀合物，其中抗体或抗体片段用含有选自由半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的至少一种氨基酸的肽修饰，并且基因或其表达产物的抑制剂经由共价键(S
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S键)、配位键或非共价键与肽结合。项4.根据项3所述的缀合物，其中，肽还包含甘氨酸或丙氨酸。项5.根据项3所述的缀合物，其中，肽为聚赖氨酸或聚精氨酸。项6.根据项5所述的缀合物，其中，肽为聚精氨酸。项7.根据项1至6中任一项所述的缀合物，其中，基因或其表达产物的抑制剂是抗miRNA核酸，并且抗miRNA核酸是通过与外泌体中含有的miRNA形成互补链来抑制miRNA功能的核酸。项8.根据项1所述的缀合物，其中抗体或抗体片段是抗CD63抗体。项9.根据项1所述的缀合物，其中，基因或其表达产物的抑制剂是外泌体中含有的miRNA或基因的抑制剂。项10.根据项1所述的缀合物，其中，基因或其表达产物的抑制剂是miRNA抑制剂。项11.根据项1所述的缀合物，其中抗体或抗体片段是单克隆抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。项12.一种癌症增殖和/或转移抑制剂，包含项1至11中任一项所述的缀合物。本专利技术的有益效果
[0010]本专利技术能够有效地抑制特别是参与癌症转移和增殖的外泌体中所含基因的功能。
附图说明
[0011]图1：本专利技术的缀合物的作用机理的示意图。图2：示出实施例1的荧光标记抗体的制备方案的示意图。图3：示出实施例1的结果的共聚焦激光显微镜图像。图4：示出实施例2的缀合物的制备方案的示意图。图5：示出实施例2和比较例1的结果的共聚焦激光显微镜图像。标题为“抗CD63 IgG+RNA(Cy5)”的上排示出比较例1的结果，标题为“抗CD63 IgG
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9r+RNA(Cy5)”的下排示出实施例1的结果。鬼笔环肽是特异性结合至构成细胞骨架的聚合肌动蛋白(F
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肌动蛋白)的寡肽，并用于细胞骨架的染色。图6：示出实施例3的制备方案的示意图。图7：将抗CD63抗体/抗miR缀合物的微小RNA功能抑制作用掺入细胞中。图8：外泌体miR21依赖的细胞增殖抑制。
图9：抗CD63抗体/抗miR核酸缀合物在体内的作用。
具体实施方式
[0012]基因或其表达产物的抑制剂是外泌体中所含基因的功能的抑制剂。其实例包括低分子化合物、miRNA抑制剂、DNA抑制剂、mRNA抑制剂、tRNA抑制剂、rRNA抑制剂、piRNA抑制剂、非编码RNA抑制剂、适体、抗体、F(ab')2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、亲合体、纳米抗体和选择性抗体支架(例如双抗体)。
[0013]在本专利技术的一个优选实施方式中，基因或其表达产物的抑制剂的实例包括低分子化合物和抗miRNA核酸。低分子化合物的实例包括顺铂、5FU(5
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氟尿嘧啶)、多柔比星、放线菌素、丝裂霉素、环磷酰胺、美法仑等。
[0014]抗体或抗体片段的实例包括单克隆抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
[0015]miRNA(微小RNA)是包含在外泌体中的RNA，具有约15至30个碱基，特别是约18至25个碱基。在本专利技术中，“外泌体”广泛地包括从哺乳动物细胞释放的囊泡。动物的实例包括人、猴、牛、绵羊、山羊、马、猪、兔、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等，特别优选人。哺乳动物细胞的实例尤其包括肿瘤细胞、树突细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、血小板、网织红细胞、上皮细胞、成纤维细胞等，特别是肿瘤细胞。外泌体的直径为约30至200nm，优选约30至100nm。
[0016]作为抗体或抗体片段的靶标的外泌体表面抗原的实例包括CD9、CD63、CD81和CD147。作为抗体或抗体片段的靶标的优选的外泌体表面抗原的实例包括CD9和CD63，更优选CD63。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种缀合物，包含靶向外泌体表面抗原的抗体或抗体片段、以及基因或其表达产物的抑制剂，其中，所述抗体或抗体片段和所述基因或其表达产物的抑制剂直接或通过连接基团共价结合、或非共价结合，所述缀合物与所述外泌体结合，并与所述外泌体一起掺入细胞中，所述外泌体表面抗原是CD63、CD9、CD81或CD147，所述基因或其表达产物的抑制剂为miRNA抑制剂或mRNA抑制剂，由外泌体在细胞内破裂而被释放，抑制参与癌转移和癌增殖的基因的功能，所述基因或其表达产物为包含在血液中分泌的外泌体中的、支配癌细胞的增殖能力和转移能力的miRNA或mRNA。2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述外泌体表面抗原是CD63、CD9或CD81。3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述外泌体表面抗原是CD63。4.根据权利要求1所述的缀合物，其中，所述miRNA抑制剂或mRNA抑制剂为单链核酸。5.根据权利要求4所述的缀合物，其中，所述单链核酸为抗miRNA核酸。6.根据权利要求5所述的缀合物，其中，所述抗miRNA核酸为抗miR21核酸。7.根据权利要求1所述的缀合物，其中，所述miRNA抑制剂或mRNA抑制剂为双链核酸。8.根据权利要求7所述的缀合物，其中，所述双链核酸为siRNA。9.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：山吉麻子，村上章，芦原英司，小堀哲生，
申请(专利权)人：学校法人京都药科大学，
类型：发明
国别省市：