一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用，涉及检测宫颈细胞基因甲基化技术领域。Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3

【技术实现步骤摘要】
一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用


[0001]本专利技术涉及检测宫颈细胞基因甲基化
，特别涉及一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用。

技术介绍

[0002]甲基化，是指从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸加工。
[0003]宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，主要组织学类型是鳞状细胞癌，其次是腺癌。宫颈鳞状细胞癌分为外生型、内生型、溃疡型、颈管型，组织学上为高分化、中分化、低分化。高发年龄为50～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。随着宫颈细胞学筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率已有明显下降。
[0004]现有的检测宫颈细胞甲基化的放入对话，需要进行内标，因而导致了定量只能终点检测的局限，无法实现每一轮循环均检测一次荧光信号的强度的问题，为此我们提出了一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
[0007]PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3
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15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10
′
SDcycle6
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15。
[0008]每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
[0009]荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全
同步。而新型TaqMan
‑
MGB探针使该技术既可进行基因定量分析。
[0010]2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
[0011]无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
[0012]2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
[0013]一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合应用内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
[0014]竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
[0015]PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
[0016]一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合试剂盒缓冲液10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。
[0017]优选的，0.1mol/LTris
‑
Cl(1000mL)，Tris碱12.11g，ddH2O800mL，HCl49mL，三者混匀充分溶解后,滴加浓盐酸调pH至8.0,定溶至1000mL。
[0018]优选的，0.01mol/LTris
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Cl(1000mL)，Tris碱1.211g，ddH2O800mL，HCl49mL，三者混匀充分溶解后,滴加浓盐酸调pH至8.0,定溶至1000mL。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：（1）、该一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用，无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。
[0020]（2）、该一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗
传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
具体实施方式
[0021]一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合
[0022]Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
[0023][0024][0025][0026]PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3
‑
15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10
′
SDcycle6...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，其特征在于,包括PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3
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15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10
′
SDcycle6
‑
15；每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数；荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料；1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，而新型TaqMan
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MGB探针使该技术既可进行基因定量分析；2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2.一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合应用，其特征在于，包括以下应用方法：内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琼英，
申请(专利权)人：深圳市赛尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：