一种鳖科动物使用的微创血液抽取方法及染色体制片方法技术

本发明专利技术公开了一种鳖科动物使用的微创血液抽取方法及染色体制片方法，属于细胞遗传学技术领域，该方法包括如下步骤：S01、将待检动物置于30℃的水族系统中暂养≥10天。S02、采用腹腔注射法对待检动物进行PHA注射。S03、抽取待检样本的血液。S04、将抗凝血与秋水仙素溶液混合，得到混合物A。S05、将混合物A与淋巴细胞分离剂混合，得到混合物B。S06、在混合物B中，吸取淋巴细胞上清液，并加入生理盐水，混匀后离心，得到淋巴细胞沉淀。S07、用0.5％KCl低渗溶液重悬淋巴细胞沉淀，37℃低渗50min，离心收集细胞。使用卡诺固定液固定2次后进行制片。该染色体制片方法具有操作步骤简单以及不会使待检动物致死的优点。检动物致死的优点。检动物致死的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种鳖科动物使用的微创血液抽取方法及染色体制片方法


[0001]本专利技术属于细胞遗传学
，具体涉及一种鳖科动物使用的微创血液抽取方法及染色体制片方法。

技术介绍

[0002]鳖科是龟鳖目的一个科，有7属23种，是爬行纲动物中一个重要类群，其外皮为皮肤而非角质盾片，这是龟类显著的形态特征。鳖科在世界上的分布以亚洲为中心。体型巨大的物种有鼋，体型小的物种有砂鳖，分布广泛的物种有特种养殖品种中华鳖。
[0003]染色体是细胞核的主要成分，是遗传信息的主要载体。染色体核型不仅具有物种特性，在不同地理群体和品种间也有差异。染色体核型分析是遗传育种及种质鉴定工作中的重要研究内容。染色体制片是核型分析的基础，是细胞遗传学的基本技术，在生物进化、遗传变异、个体发育、疾病诊断等方面发挥重要作用。
[0004]水生动物染色体制片，其技术核心是获得足量分裂旺盛组织细胞，然后使用秋水仙素处理破坏纺锤体，使分裂细胞停止于有丝分裂中期，再采用细胞分离、低渗、固定、滴片等操作制片。根据物种不同选取不同组织用于染色体制片，成体组织如鱼类头肾、鳖类股骨骨髓细胞等造血组织，也可采用分裂旺盛的胚胎组织、幼鱼鳃组织等。制备方式主要分为两类：1)是直接获取适宜组织制片，如利用体腔注射植物血球凝集素(PHA
‑
P)，刺激造血器官内的淋巴细胞大量增殖，然后利用秋水仙素进行处理，使细胞的分裂停留在中期，解剖分离相应器官开展染色体制片。2)是通过细胞培养方法获取适宜分裂旺盛组织细胞制片，如取鱼类头肾组织、上皮细胞、血细胞进行细胞培养，获得足量细胞后，利用秋水仙素处理，开展染色体制片。
[0005]对于鳖科动物而言，传统方法应采取腹腔注射PHA，随后注射秋水仙素，再处死动物取股骨进行制片；或者处死动物分离肾、脾、外周血，进行细胞培养后再秋水仙素处理，收集细胞进行制片。目前鳖科动物取外周血方法只有断头取血和腹板开孔暴露心脏左动脉弓取血，均需要牺牲检测对象。仅对极个别大型物种，如鼋、斑鳖等，可以通过皮肤毛细血窦采集少量血液进行细胞培养。因此，上述常规染色体制片方法具有如下缺陷：(1)造成待检动物死亡，对于鳖类中的保护物种和濒危物种，尤其是中小体型物种，是不适用的；(2)需要建设专业细胞培养平台，投入大，操作技术要求高。因此，开发一种既可以微创采样不牺牲待检动物，又能省略繁琐细胞培养，简化实验操作的染色体制片方法，对于鳖科动物种质研究意义重大。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种鳖科动物微创免细胞培养的染色体制片方法，该染色体制片方法具有操作步骤简单、无需细胞培养以及不会使待检动物致死的优点。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种鳖科动物使用的微创血液抽取方法，该微创血液抽取方法包括如下步骤：
[0009](1)、待检动物经PHA注射24
‑
36h后，采用抗凝剂润洗过的注射器从鳖类背甲与尾部连接缝隙处沿45
°
进针，直至针尖刺破椎管硬膜，阻力消失。
[0010](2)、针尖向椎管背侧缓慢贴近，同时抽拉注射器活塞，当针尖刺入椎管背侧血管时，即可抽取血液，得到抗凝血。
[0011]本专利技术还提供了一种基于微创血液抽取技术的染色体制片方法，该染色体制片方法包括如下步骤：
[0012]S01、动物暂养：将待检动物置于30℃的水族系统中暂养≥10天。
[0013]S02、注射PHA：采用腹腔注射法对待检动物进行PHA注射，其中：PHA溶液浓度为1mg/mL，注射剂量为5
‑
10ug/g体重。
[0014]S03、血液抽取量为1.5
‑
2mL。
[0015]S04、秋水仙素处理：将抗凝血与生理盐水配置的浓度为300
‑
400ng/ml秋水仙素溶液等体积混合，得到混合物A。
[0016]S05、淋巴细胞分离：在15毫升离心管a内，将混合物A与等体积淋巴细胞分离液混合，保持在20
±
2℃温度下自然沉降30～45min，得到混合物B。
[0017]S06、淋巴细胞清洗：在自然淋巴细胞分离完成后的混合物B中，用吸管吸取上清液，转移至15毫升离心管b，并在15毫升离心管b中加入多于上清液2～3倍体积的生理盐水，混匀后1000rpm离心10～15min，上清液弃去，得到淋巴细胞沉淀。
[0018]S07、染色体制片：用0.5％KCl低渗溶液重悬沉淀物，37℃低渗50min；低渗后，用1000rpm的离心转速收集细胞。
[0019]使用甲醇与冰醋酸体积比为3：1的卡诺固定液固定2次，然后采用冷玻片干燥法进行制片。使用瑞氏吉姆萨染液染色10min。
[0020]作为优选，在步骤S01中，待检动物暂养条件为30℃，时间为10天。
[0021]作为优选，在步骤S02中，PHA溶液浓度为1mg/mL，注射剂量为8ug/g体重。
[0022]作为优选，在步骤S03中，抗凝剂是枸橼酸钠。
[0023]作为优选，在步骤S05中，淋巴细胞分离液由平均分子量500kDa的羟乙基淀粉与生理盐水配置，浓度为5～7％。
[0024]作为优选，在步骤S06中，离心时间为13min。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0026](1)无需处死待检动物，以外周血为检材开展染色体制片，对动物伤害小。
[0027](2)采用创新的鳖类采血方法，小型鳖类也可抽取足量检测血液，创伤微小。
[0028](3)无需昂贵的细胞培养设施建设，省略繁琐的细胞培养步骤，节省大量经济成本和时间。
附图说明
[0029]图1为实施例1制备得到的中华鳖染色体标本；
[0030]图2为实施例1制备得到的中华鳖染色体标本；
[0031]图3为实施例1制备得到的中华鳖染色体标本；
[0032]图4为实施例1制备得到的中华鳖染色体标本；
[0033]图5为实施例1中待检动物示意图；
[0034]图6为实施例1中待检动物身上定位抽血穿刺点示意图；
[0035]图7为实施例1中待检动物身上穿刺抽血位点示意图；
[0036]图8为实施例1中对待检动物实施抽血操作示意图；
[0037]图9为角鳖微创抽血后生命活动体征状态表；
[0038]图10为中华鳖微创抽血后生命活动体征状态表。
具体实施方式
[0039]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0040]实施例1
[0041]一种鳖科动物微创免细胞培养的染色体制片方法，该染色体制片方法包括如下制备步骤：(本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鳖科动物使用的微创血液抽取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、待检动物经PHA注射24
‑
36h后，采用抗凝剂润洗过的注射器从鳖类背甲与尾部连接缝隙处沿45
°
进针，直至针尖刺破椎管硬膜，阻力消失；(2)、针尖向椎管背侧缓慢贴近，同时抽拉注射器活塞，当针尖刺入椎管背侧血管时，即可抽取血液，得到抗凝血。2.基于微创血液抽取技术的染色体制片方法，其特征在于，包括如下步骤：S01、动物暂养：将待检动物置于30℃的水族系统中暂养≥10天；S02、注射PHA：采用腹腔注射法对待检动物进行PHA注射，其中：PHA溶液浓度为1mg/mL，注射剂量为5
‑
10ug/g体重；S03、血液抽取量为1.5
‑
2mL；S04、秋水仙素处理：将抗凝血与生理盐水配置的浓度为300
‑
400ng/ml秋水仙素溶液等体积混合，得到混合物A；S05、淋巴细胞分离：在15毫升离心管a内，将混合物A与等体积淋巴细胞分离液混合，保持在20
±
2℃温度下自然沉降30～45min，得到混合物B；S06、淋巴细胞清洗：在自然淋巴细胞分离完成后的混合物B中，用吸管吸取上清液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海琪，陈静，姚嘉赟，袁雪梅，黄雷，焦锦彪，潘晓艺，沈锦玉，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：