用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法技术

本发明专利技术属于医学技术领域，具体涉及用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，包括红细胞代用品的制备和治疗急性失血性贫血的方法，其特征在于：所述红细胞代用品的制备采用辛二酸二琥珀酰亚胺酯作为分子内交联剂交联血红蛋白的亚基。本发明专利技术将乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)作为蛋白质交联剂,用来交联血红蛋白(Hb),制备红细胞代用品不但稳定了血红蛋白四聚体结构,使其不容易解聚为二聚体造成肾毒性。肾毒性。肾毒性。

【技术实现步骤摘要】
用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法


[0001]本专利技术属于医学
，具体涉及用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法。

技术介绍

[0002]医学实践表明，对于急性大量失血的患者，如在受伤早期几小时内得到有效的血液补充，救治率可达90％以上，研究人血代用品自然面然也就成了世界各国科学家争先涉足的领域，用动物血液代替人血是人血代用品的主攻方向，血液中的最主要成分是人血红细胞，研究人血代用品，实际上就是研究人血红细胞代用品，血红蛋白是人血红细胞中的具有携氧功能的有效成分，我国科学家采用现代生物技术手段以动物血红蛋白为原料，采用分子修饰的方法有效的解决了输血过程致命的免疫反应，最终将动物血红蛋白转化为安全有效的人血红蛋白代用品。
[0003]公开号为CN1913896B的中国专利公开了用于治疗和控制血红蛋白病和贫血病的方法和组合物，涉及免疫调节化合物，具体是一类称作IMiDTM的化合物成员，更具体是化合物4
‑
(氨基)
‑2‑
(2，6
‑
二氧代(3
‑
哌啶基))
‑
异吲哚啉
‑
1，3
‑
二酮和3
‑
(4
‑
氨基
‑1‑
氧代
‑
1，3
‑
二氢异吲哚
‑2‑
基)
‑
哌啶
‑
2，6
‑
二酮的用途，用于在CD34+细胞群中诱导胎儿血红蛋白的基因、红血球生成必需基因、和编码α血红蛋白稳定蛋白的基因的表达。这些化合物用于治疗血红蛋白病，如镰刀型细胞贫血病或β
‑
地中海贫血症，或因为疾病、手术、意外事件、或者毒素、毒药或药物的引入或摄入所引起的贫血病。
[0004]但是，仍然存在以下问题：
[0005]在急性失血引起的急症期间输血是不理想的，因为没有时间检测供体和接受者血液之间的相容性，而且总会存在触发与存在于供体血液中的免疫成分相关的许多并发症(例如RBC的溶血、过敏性反应、输血相关的急性肺损伤、移植物抗宿主疾病、细菌污染、病毒性疾病的传染等)的风险。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的上述不足之处，本专利技术提供了用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，用以解决现有技术种触发与存在于供体血液中的免疫成分相关的许多并发症等问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下技术方案：
[0008]用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，包括红细胞代用品的制备和治疗急性失血性贫血的方法，所述红细胞代用品的制备采用辛二酸二琥珀酰亚胺酯作为分子内交联剂交联血红蛋白的亚基。交联产物中83.8％为重均分子量(Mw)66.8kD的分子内交联血红蛋白，16.2％是Mw为146.6和306.4kD的低聚血红蛋白，通过流动相中添加1molLMgCl的凝胶过滤色谱验证，交联后的血红蛋白在生理环境下不会解聚。联用反相高效液相色谱与质谱(RP
‑
HPLC
‑
MS)初步确定，交联为非定点反应，主要在α
‑
α亚基间进行.交联
反应增强了血红蛋白亚基的疏水性,影响了血红蛋白的载氧活性，P
50
和Hill系数由交联前的21.8和2.22mmHg分别降至14.3和1.41mmHg,仍具有一定的载氧能力。
[0009]优选的，所述红细胞代用品的制备在局部百级的洁净室内进行，所述红细胞代用品的制备在低温4℃下反应1h。如图二所示，其中等电点5.2处有一条清晰的带,大部分集中于4.6～4.7,4.7～4.9有一扩散型条带区,推测是由于修饰度不同而使血红蛋白表面带电荷情况不一。
[0010]优选的，所述红细胞代用品的制备交联血红蛋白的等电点降至4.6～5.2之间，接近于不透过血管壁的血清白蛋白。取新鲜牛血(已加入3％柠檬酸钠抗凝)经离心分离红细胞,洗涤溶胀破裂红细胞,得到的血红蛋白溶液经过微滤和超过滤两次膜分离与QSepharoseBigBeads阴离子交换层析组合纯化得到高纯度的血红蛋白溶液。
[0011]优选的，所述红细胞代用品的制备用bis
‑
Tris配制1mmol/L血红蛋白溶液(6.45g/dL),pH7.2,通入N2制备脱氧血红蛋白，以交联剂与血红蛋白摩尔比1.5:1加入双阿司匹林,25℃搅拌反应1h后用2mol/L甘氨酸中止。
[0012]6、优选的，所述治疗急性失血性贫血的方法分为以下步骤：
[0013]人群选择：IDA患者80例男28例女52例平均年龄(48+8.0)岁。非IDA患者72例,男30例女42例平均年龄(46+7.2)岁其中急性贫血22例慢性贫血23例恶性肿瘤15例其他慢性疾病继发性贫血12例。健康对照组81例；
[0014]检测方法：受试者静脉采血2mL注入EDTA
‑
K2真空抗凝管中混匀严格按仪器操作程序进行质控品随样本
‑‑
同测定2h内完成，批间CV值<3％；
[0015]3组患者Ret
‑
He、MCH、MCV、Hb检测结果比较:IDA组与对照组比较,Ret
‑
He、MCH、MCV、Hb差异有统计学意义(P<0.05)；IDA组与非IDA组比较,Ret
‑
He、MCH、MCV差异有统计学意义(P<0.05),Hb差异无统计学意义(P>0.05)；非IDA组与对照组比较,Hb差异有统计学意义(P<0.05)。采用SPSS13.0统计软件计量资料以x士s表示多组间均数比较采用方差分析2组间比较用t检验以P<0.05为差异有统计学意义，应用受试者工作特征(ROC)曲线评价各指标对IDA诊断的临床价值。
[0016]本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0017]本专利技术的用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，将乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)作为蛋白质交联剂,用来交联血红蛋白(Hb),制备红细胞代用品。探索了这一交联反应的可行性，优化了交联条件，不同的反应条件下可得到不同的反应产物，在35℃、pH8.7、较低的血红蛋白浓度(20mg/ml)和相对较高的修饰剂比例(摩尔比EGDE:Hb＝100:1)下反应4小时，主要产物为分子内部亚基之间交联的血红蛋白，且分子内交联血红蛋白相对总蛋白含量90％以上；在脱氧情况下定点交联血红蛋白的两个α亚基(lysine99
α1‑
lysine99
α
2),不但稳定了血红蛋白四聚体结构,使其不容易解聚为二聚体造成肾毒性。
附图说明
[0018]图1为本专利技术用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法实施例中交联产物组成表；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，包括红细胞代用品的制备和治疗急性失血性贫血的方法，其特征在于：所述红细胞代用品的制备采用辛二酸二琥珀酰亚胺酯作为分子内交联剂交联血红蛋白的亚基。2.根据权利要求1所述的用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，其特征在于：所述红细胞代用品的制备在局部百级的洁净室内进行，所述红细胞代用品的制备在低温4℃下反应1h。3.根据权利要求1所述的用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，其特征在于：所述红细胞代用品的制备交联血红蛋白的等电点降至4.6～5.2之间，接近于不透过血管壁的血清白蛋白。4.根据权利要求1所述的用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，其特征在于：所述红细胞代用品的制备用bis
‑
Tris配制1mmol/L血红蛋白溶液(6.45g/dL),pH7.2,通入N2制备脱氧血红蛋白，以交联剂与血红蛋白摩尔比1.5:1加入双阿司匹林,25℃搅拌反应1h后用2mol/L甘氨酸中止。5.根据权利要求1所述的用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵押金，梁鲁彪，喻永林，徐高强，王苑茹，
申请(专利权)人：遵义医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：