一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术提供一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用，涉及动物病毒检测技术领域。本发明专利技术的检测穿山甲β冠状病毒的引物组包括外引物和内引物，各引物的序列如SEQID No.1～SEQ ID No.4下所示。本发明专利技术的环介导等温扩增试剂、试剂盒包括上述引物组。本发明专利技术的检测方法采用上述引物组、环介导等温扩增试剂或试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增。本发明专利技术的产品和检测方法具有特异性高、灵敏度高、重复性好等优点。重复性好等优点。重复性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测穿山甲
β
冠状病毒的引物组、试剂盒和应用


[0001]本专利技术涉及动物病毒检测
，特别是涉及一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒是一种具有囊膜的单股正链非节段的RNA病毒。根据国际病毒分类委员会当前的命名法则，冠状病毒科分为4个属，即Alpha、Beta、Gamma和Delta冠状病毒属，其中Alpha，Beta，Gamma冠状病毒属分别分别对应于以前的1、2和3群。同时，Beta冠状病毒属在进化上又可进一步分为A、B、C和D四个不同的群(或谱系)。
[0003]穿山甲是穴居动物，免疫系统较特殊，易感染多种病原微生物，其所居住或觅食的洞穴不仅有穿山甲活动，也可能有蝙蝠、豪猪、黄腹鼬、果子狸、竹鼠、蛇等动物的活动，因此穿山甲有可能感染或传播多种病原微生物，从而成为疫病的中间宿主，甚至是某些具有重大公共卫生风险的病原微生物携带者。现有的研究表明，穿山甲可以感染BETA冠状病毒，且谱系复杂，不仅有B谱系，还有A谱系。其中B谱系与人SARS
‑
Cov
‑
2具有一定的相关性，对于研究SARS
‑
Cov
‑
2的溯源、进化、变异与跨物种传播等研究具有极其重要的价值。而通过对穿山甲冠状病毒的报道分析，推断穿山甲的携带的BETA冠状病毒种类更多，传播地区比目前所检测到地区更广，因此需要更快速、更简便的方法进行更多地区和更多穿山甲及相关物种的检测。
[0004]环介导等温扩增(loop
‑
mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi等人发展起来的技术。LAMP具有较高的特异性和灵敏度，操作简单，不需要专门的设备。LAMP是用具有链置换活性的BstDNA聚合酶(即来自嗜热脂肪芽胞杆菌的修饰DNA聚合酶)进行的。温度从61℃到69℃，在等温条件下在30
‑
60min内完成检测。最终的扩增产物是带有不同茎的茎环DNA的混合物，可以通过直接观察或通过琼脂糖凝胶进行分析。LAMP方法已被开发用于检测多种病毒，包括口蹄疫病毒、登革热病毒、风疹病毒和西尼罗河病毒，但尚未应用于检测穿山甲源BETA冠状病毒(Pan
‑
β
‑
Cov)。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要针对上述问题，提供一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。
[0006]本专利技术提供的检测穿山甲β冠状病毒的引物组，包括外引物和内引物，各引物的序列如下：
[0007]上游外引物F3：
[0008]5’‑
CAGACTTTTTCAGTATTAGCTTGTT
‑3’
(SEQ ID No.1)
[0009]下游外引物B3：
[0010]5’‑
AGGTACCTTCTAAATCTGTGC
‑3’
(SEQ ID No.2)
[0011]上游内引物FIP：
[0012]5’‑
ACAAGAACCATTAAGGAATGATCCTCCATCAGGTGTTTACCAGT
‑3’
(SEQ ID No.3)
[0013]下游内引物BIP：
[0014]5’‑
AGACTATGACTGTGTCTCTTTTTGCCCGCATGTACTCCTGTTG
‑3’
(SEQ ID No.4)。
[0015]上述引物组是针对Pan
‑
β
‑
Cov基因组相对保守的靶基因(ORF
‑
1ab)序列设计，Pan
‑
β
‑
Cov病毒已公布的基因组序列中ORF1ab基因序列较长且保守性较好，利用该序列设计的引物，用于检测穿山甲β冠状病毒具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。
[0016]在其中一个实施例中，所述引物组还包括环引物，所述环引物的序列如下：
[0017]环引物LB：5
’‑
TACATGCATCACATGGAACTTC
‑3’
(SEQ ID No.5)。
[0018]在其中一个实施例中，所述外引物、内引物和环引物的摩尔比为(3～5)：1：(1～3)。
[0019]在其中一个实施例中，所述外引物、内引物与环引物的摩尔比为4：1：2。
[0020]本专利技术还提供一种检测穿山甲β冠状病毒的环介导等温扩增试剂，包括本专利技术所述的引物组。
[0021]本专利技术还提供一种检测穿山甲β冠状病毒的试剂盒，包括本专利技术所述的引物组或环介导等温扩增试剂。
[0022]在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括荧光目视检测试剂、10
×
反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、水、阳性标准品。
[0023]在其中一个实施例中，所述DNA聚合酶为BstⅡDNA聚合酶。
[0024]本专利技术还提供一种穿山甲β冠状病毒的检测方法，采用本专利技术所述的引物组，或本专利技术所述的环介导等温扩增试剂，或本专利技术所述的试剂盒，对待测样品进行环介导等温扩增。
[0025]上述检测方法，操作简便、无需复杂昂贵仪器，检测快速高效；从提取样品到结果判定可在60min内完成，时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当；反应结果判定方法简单，不仅可以通过琼脂糖凝胶核酸电泳判断结果，还可以通过荧光染料在紫外光照射下肉眼判断结果。
[0026]本专利技术的检测方法可以实现Pan
‑
β
‑
Cov的快速、即时检测，从而解决Pan
‑
β
‑
Cov检测耗时、费力、高成本的问题，使检测灵敏度和特异性得到提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期。
[0027]在其中一个实施例中，所述环介导等温扩增的反应体系包括：10
×
反应缓冲液2.5μL，40μM FIP、40μM BIP、10μM F3、10μM B3、20μM LB各1μL，8000U/mL BstⅡDNA聚合酶1μL，HNB 21μL，100mM MgSO
4 2.5μL，10mM dNTP 3.5μL，10mM甜菜碱(betaine)2μL，待检样品cDNA模板1μL，其余用水补足至25μL
[0028]荧光目视试剂(HNB)在反应前加入，污染小，Mg
2+
与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg
2+
与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了Mg
2+
使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，以此判断LAMP反应结果。实时肉眼监测，不需要开盖，不需要电泳，非常方便。
[0029]在其中一个实施例中，所述环介导等温扩增的反应条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组，其特征在于，包括外引物和内引物，各引物的序列如下：上游外引物F3：5
’‑
CAGACTTTTTCAGTATTAGCTTGTT
‑3’
(SEQ ID No.1)下游外引物B3：5
’‑
AGGTACCTTCTAAATCTGTGC
‑3’
(SEQ ID No.2)上游内引物FIP：5
’‑
ACAAGAACCATTAAGGAATGATCCTCCATCAGGTGTTTACCAGT
‑3’
(SEQ ID No.3)下游内引物BIP：5
’‑
AGACTATGACTGTGTCTCTTTTTGCCCGCATGTACTCCTGTTG
‑3’
(SEQ ID No.4)。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括环引物，所述环引物的序列如下：环引物LB：5
’‑
TACATGCATCACATGGAACTTC
‑3’
(SEQ ID No.5)。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述外引物、内引物和环引物的摩尔比为(3～5)：1：(1～3)。4.一种检测穿山甲β冠状病毒的环介导等温扩增试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟俊琼，陈武，单芬，沈永义，周妞，李婉萍，
申请(专利权)人：广州动物园，
类型：发明
国别省市：