一种人冠状病毒HCoV-229E的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人冠状病毒HCoV

【技术实现步骤摘要】
一种人冠状病毒HCoV
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229E的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，特别涉及一种人冠状病毒HCoV
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229E的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒在系统分类上属冠状病毒属(Coronavirus)，基因组为线性单股正链的RNA 病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。病毒有包膜，电子显微镜观察这些包膜上有形状类似日冕的棘突，故命名这类病毒为冠状病毒。冠状病毒通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏、接触传染，并通过空气飞沫传播。冠状病毒感染分布在全世界多个地区，并多次引起大流行。新冠肺炎的病原菌新型冠状病毒(2019
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nCoV或SARS
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CoV
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2，引发新型冠状病毒肺炎COVID
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19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV
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229E、HCoV
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OC43、HCoV
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NL63、HCoV
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HKU1、SARS
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CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS
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CoV(引发中东呼吸综合征)。HCoV
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229E是具有急性呼吸道症状的成年患者的常见和重要病原体，通常会导致较轻的流感样疾病。潜伏期范围为2
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5d，主要在冬季流行，人群普遍易感，通过呼吸道飞沫传播。
[0003]现有的人冠状病毒检测技术主要通过病毒的分离鉴定，依赖于检测病原和抗体进行血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法和检测遗传物质的分子检测技术，包括PCR、核苷酸杂交和测序技术。这些技术各有优势，但在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面也存在一个或多个局限。比如病毒分离鉴定操作复杂、耗时长；血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法容易出现交叉反应，导致检测不准确，且不能监测变异；PCR检测技术一次反应仅针对一种病毒的1到2个标记进行检测，效率低下，且容易由于病毒的变异导致检测失败。宏基因组测序技术是另一种检测人冠状病毒的技术，但其往往包括大量的宿主测序数据，对低病毒载量的样本进行检测时，尤其需要超深度的测序，导致高的成本。
[0004]因此，开发快速、准确的、一次性高通量的检测分型多种人冠状病毒的人冠状病毒检测分析方法对于人冠状病毒的检测和防疫都具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种人冠状病毒HCoV
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229E的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对人冠状病毒HCoV
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229E进行鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种人冠状病毒HCoV
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229E的MNP标记位点，所述MNP 标记位点是指在人冠状病毒HCoV
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229E基因组上筛选的物种特异的且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括人冠状病毒HCoV
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229E参考基因组NC_002645.1上的8 个标记。
[0007]说明书表1对其进行了进一步的说明，表1中标注的所述MNP标记位点的起始和终止位置是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。
[0008]在本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括8对引物，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16所示。说明书表1对其进行了进一步的说明。
[0009]在本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测所述人冠状病毒HCoV
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229E MNP标记位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。
[0010]进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
[0011]以及上述标记、引物组合物和试剂盒在非疹断目的的人冠状病毒HCoV
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229E定性检测中的应用，在制备人冠状病毒HCoV
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229E定性检测产品中的应用。
[0012]在本专利技术的第四方面，提供了所述的人冠状病毒HCoV
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229E的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在人冠状病毒HCoV
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229E的鉴定、DNA 指纹数据库的构建、遗传变异检测中的应用。
[0013]以上所述的应用中，首先是获取待测样本的病毒总RNA；利用商业化试剂盒对所述总 RNA进行cDNA合成；利用本专利技术的试剂盒对所述cDNA和空白对照进行第一轮多重PCR 扩增，循环数不高于25个；对扩增产物进行纯化后，进行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加；对第二轮扩增产物纯化后定量；检测多个毒株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序；测序结果比对到所述的人冠状病毒HCoV
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229E的参考序列上，获取在所述cDNA中的检测序列数目和基因型数据。根据在所述cDNA和所述空白对照获得的人冠状病毒测序序列数量和检出MNP标记位点的数目，对所述cDNA的测序数据进行数据质量控制和数据分析，获得在所述样本中检出的人冠状病毒HCoV
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229E的MNP 标记位点数目、覆盖每个所述MNP标记位点的测序序列数目和所述MNP标记位点基因型数据。
[0014]当用于人冠状病毒HCoV
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229E鉴定时，根据在待测样品和空白对照中检出的人冠状病毒HCoV
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229E的测序序列数量和检出MNP位点的数目，进行质控后判定待测样品中是否含有人冠状病毒HCoV
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229E的核酸。其中，所述的质控方案和判定方法是以拷贝数已知的人冠状病毒HCoV
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229E的RNA为检测样本，评估所述试剂盒检测人冠状病毒HCoV
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229E 的灵敏度、准确性和特异性，制定所述试剂盒检测人冠状病毒HCoV
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229E时的质控方案和判定方法。
[0015]当用于人冠状病毒HCoV
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229E遗传变异检测时，包括HCoV
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229E感染病例个体间和个体内部毒株的遗传变异检测。个体间毒株的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方法，获得待比较个体所感染毒株在8个MNP标记位点的基因型数据。通过基因型比对，分析毒株间在所述8个MNP标记位点上的主基因型是否存在差异。若所比较毒株在至少一个MNP 标记位点的主基因型存在变异，则判定两者存在遗传变异。作为一种备选方案，也可以通过单重PCR对待比较毒株的8个标记分别进行扩增，然后对扩增产物进行Sanger测序，获得序列后，对待比较毒株每个MNP标记位点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人冠状病毒HCoV
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229E特异的MNP标记位点，其特征在于，所述MNP标记位点为在人冠状病毒HCoV
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229E基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括：以NC_002645.1为参考基因组的MNP
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1～MNP
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8的8个MNP标记位点。2.一种用于检测权利要求1所述人冠状病毒HCoV
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229E MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括8对引物，具体的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16所示。3.一种用于检测权利要求1所述人冠状病毒HCoV
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229E MNP标记位点的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。5.权利要求1所述的人冠状病毒HCoV
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229E的MNP标记位点或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3
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4任一所述的检测试剂盒在非疹断目的的人冠状病毒HCoV
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【专利技术属性】
技术研发人员：万人静，方治伟，高利芬，陈利红，肖华锋，李甜甜，李论，周俊飞，彭海，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：