一种双载体AAVDNA重组的检测方法技术

本发明专利技术属于基因治疗领域，双载体AAV进行DNA重组后，对DNA重组的检测方法。OTOF是一个导致耳聋的重要基因，通过AAV双载体递送OTOF基因实现OTOF基因突变的耳聋将为该类患者耳聋恢复提供希望。本发明专利技术开发了一种AAV双载体在DNA水平重组检测的方法。该方法可以用于在DNA水平对AAV的活性进行检测，并且评估AAV的稳定性。稳定性。稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种双载体AAV DNA重组的检测方法


[0001]本专利技术属于基因治疗领域，双载体AAV进行DNA重组后，对DNA重组的检测方法。

技术介绍

[0002]耳是人体的重要器官，由外耳、中耳和内耳构成，其主要功能是感知声音和维持身体平衡。当耳功能异常时会导致一系列身体机能的病变，包括耳聋，耳鸣，眩晕等。
[0003]耳聋是一种听觉功能异常的常见疾病，可分为先天性耳聋和后天性耳聋，多与遗传因素和环境因素相关。每1000个新生婴儿中就有2位先天性耳聋，其中50
‑
60%患者的耳聋均由基因突变引起；基因突变导致的耳聋可分为显性基因突变和隐性基因突变。其中，隐性耳聋基因包括CLDN14，PJVK，GRXCR1，MYO7A，MYO6，MYO3A，MYO15A，OTOF，OTOG，OTOA，STRC，TMC1，SLC22A4，SLC26A4，SLC26A5，TECTA，GJB2和GJB6等。这些耳聋基因的发现为遗传性耳聋的精准治疗提供潜在的靶点，因此当上述基因引发耳聋时，基因治疗可以作为耳聋根治的首选策略。
[0004]基因治疗是指通过在DNA或RNA层面进行纠正、补偿或抑制，从而使体内核酸序列或表达异常所引起的疾病恢复，达到治疗目的的方法。目前大部分基因治疗都需要载体递送，腺相关病毒（Adeno
‑
Asociated Virus，AAV）是其中一种安全、高效的递送载体，它的包装容量约为4.7 Kb。然而，在耳聋领域，许多基因编码区长度并不适合腺相关病毒的包装，如BDP1，CDH23，COL11A2，LOXHD1，MET，MYO15A，MYO3A，MYO7A，OTOG，OTOF，OTOGL，PCDH15，PTPRQ，STRC，TECTA，TARA等，它们的编码区长度均超过4 kb，连同相关调控元件会超过AAV载体的包装限制。尽管目前采用DNA重组双载体解决了该问题，但DNA重组双载体包装在体内重组效率较低。
[0005]在编码序列长度大于4kb的耳聋相关基因中，OTOF在听力中发挥了重要作用。OTOF蛋白主要表达在耳蜗的内耳毛细胞中，主要作用是结合钙离子（Ca
2+
），并启动下游神经递质的释放。OTOF基因的缺失或功能丧失性突变会引起DFNB9耳聋。
[0006]对于OTOF基因突变引起的先天性耳聋来说，尽管AAV具有递送不整合，表达时间长，免疫原性低等特点，是首选的运载工具，但AAV包装容量小于4.7 kb，存在包装限制问题，无法满足OTOF基因的包装（OTOF基因加上调控序列全长超过7 kb）。为了解决OTOF的包装问题，目前主要采用AAV双载体进行递送，在体内进行DNA重组并转录及翻译得到最终的OTOF蛋白。
[0007]其中DNA在体内的重组是OTOF蛋白表达的重要步骤和前提，因此DNA的重组的检测作为AAV活性的检测中非常重要。但是由于在正常的动物和细胞基因组上存在原有OTOF基因，容易对双载体AAV重组的OTOF检测造成影响。通过引物和PCR体系的优化，本专利技术提供了一种能够检测双载体DNA重组片段的检测方法。

技术实现思路

[0008]双载体AAV递送进行OTOF突变的耳聋恢复是OTOF突变耳聋治疗的重要方法。但双
载体AAV进行OTOF基因的递送的效率是一个难题，其中双载体中的DNA的重组是一个重要步骤。对此步骤进行检测，有利于理解双载体递送中AAV的重组过程，也是OTOF双载体AAV重要活性检测指标。
[0009]本专利技术提供了一种能够检测OTOF双载体AAV进入到细胞后重组检测的PCR方法，PCR体系中包含所用的模板，酶及缓冲体系和引物：本专利技术PCR体系中的模板可以是细胞或者组织裂解液，也可以是从细胞或者组织中提取的DNA。在PCR体系中的模板含量为0.001
‑
1000ng/10μL优选地，PCR体系中的DNA模板含量为0.1
‑
100ng/10μL。
[0010]优选地，PCR体系中的DNA模板含量为0.1
‑
50ng/10μL。
[0011]优选地，PCR体系中的DNA模板含量为1
‑
20ng/10μL。
[0012]优选地，PCR体系中的DNA模板含量为5ng/10μL。
[0013]本专利技术PCR体系中使用的酶主要是可以是taq，pfu，KOD，I
‑5TM
，Q5
TM
等酶及其衍生物，以及和这些酶相适应的缓冲液体系，体系中Mg
2+
浓度为0
‑
10mM，pH为6.0
‑
10.0，DMSO浓度为0
‑
20%，K
+
浓度为0
‑
200mM，Na
+
浓度为0
‑
200mM，甘油浓度为0
‑
30%，Tris
‑
HCl或HEPES的浓度为10
‑
50mM，DTT的浓度为0
‑
5mM，EDTA的浓度为0
‑
5mM，dNTP的浓度为0
‑
1mM。
[0014]优选地，PCR体系中使用的酶为I
‑5TM
，缓冲体系为I
‑5TM
Reactionbuffer（Tris
‑
HCl的浓度为4mM，KCl的浓度为20mM，DTT的浓度为0.2mM，EDTA的浓度为0.02mM，BSA的浓度为40μg/ml，MgCl的浓度为2mM，甘油浓度为10%，dNTP的浓度为0.2mM，pH=7.4），DMSO的浓度为0
‑
5%。
[0015]优选地，PCR体系中使用的酶为I
‑5TM
，缓冲体系为I
‑5TM
Reactionbuffer（Tris
‑
HCl的浓度为4mM，KCl的浓度为20mM，DTT的浓度为0.2mM，EDTA的浓度为0.02mM，BSA的浓度为40μg/ml，MgCl的浓度为2mM，甘油浓度为10%，dNTP的浓度为0.2mM，pH=7.4），DMSO的浓度为2.5%。
[0016]本专利技术PCR体系中使用地引物分别选自OTOF双载体的其中一个质粒，PCR体系中的终浓度为0.1
‑
5μM。
[0017]优选地，PCR体系中使用的引物正向引物选自SEQIDNO.1或SEQIDNO.2，PCR体系中使用的引物反向引物选自SEQIDNO.3或SEQIDNO.4，正反向引物的浓度分别为0.1
‑
1μM。
[0018]优选地，PCR体系中使用的引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.3，正反向引物的浓度分别为0.5μM。
[0019]有益效果：通过本项目的优化能够扩增得到进入到细胞中的OTOFAAV双载体重组片段，并能够通过切胶测序进一步确认DNA重组的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测OTOF AAV双载体DNA重组的PCR检测方法：其特征在于用于检测OTOF AAV双载体进入细胞或者组织中DNA重组的PCR方法，PCR体系中包含引物、DNA聚合酶和缓冲体系。2.如权利要求1中所述，PCR体系中引物序列分别选自OTOF双载体的其中一个载体。3.权利要求2中所述其中一个引物为SEQ ID NO.1，另外一个引物为SEQ ID NO.3；或者所述其中一个引物为SEQ ID NO.2，另外一个引物为SEQ ID NO.4。4.如权利要求1所述，PCR体系DNA聚合酶是耐高温生物的DNA聚合酶或其衍生物。5.权利要求4中所述的DNA聚合酶为taq；或者pfu；或者KOD；或者I...

【专利技术属性】
技术研发人员：高凯瑜，赵紫维，李碧君，
申请(专利权)人：上海鼎新基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：