一种斑马鱼糖尿病血管病变模型的构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术模型构建领域，具体公开一种斑马鱼糖尿病血管病变模型的构建方法，包括以下步骤：将受精后发育1d

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼糖尿病血管病变模型的构建方法


[0001]本专利技术属于生物技术模型构建领域，具体公开一种斑马鱼糖尿病血管病变模型的构建方法。

技术介绍

[0002]随着人口增长、老龄化，以及超重、肥胖负担的增加等，全球的糖尿病发病率快速增长，其中2型糖尿病的发病率占绝大多数，而2型糖尿病引发的大血管和微血管病变也逐年增加，给患者及家属的身心带来巨大的痛苦，并给医疗保健系统带来巨大负担。糖尿病(DM)以血液内葡萄糖(血糖)水平不断升高为特征，其发生或是因为胰腺不能分泌足够的胰岛素来调整血糖，或是因为身体不能有效使用其所分泌的胰岛素。随着时间的推移会导致心脏、血管、眼睛、肾脏和神经受到严重损害。超过30％的糖尿病患者患有微血管和大血管并发症，这些并发症是全球主要的死亡原因。然而，对于糖尿病并发症的治疗，目前还没有很好的治疗药物。
[0003]尽管存在一些治疗DM的疗法，例如用于T1DM和T2DM的胰岛素治疗和抗糖尿病药物，如二甲双胍和其他用于T2DM的药物，但糖尿病视网膜病变、肾病或神经病变等并发症的发生率仍在上升。为了进一步提高治疗效率和识别新的疾病机制，建立了各种动物模型。因此，大鼠和小鼠代表了最常见的动物模型，并且在这些动物中已经确定了几种重要的病理生理机制，但其周期长，耗费大。并且，这些模式生物不能完美地反映糖尿病患者的代谢背景。为了填补这一空白，需要新的动物模型和新的构建方法。因此，构建一种可视化动态观察糖尿病血管病变模型很有必要。
[0004]利用模式生物斑马鱼构建斑马鱼糖尿病血管病变模型，可以通过实时观察血管病变的过程了解糖尿病血管病变的原因。斑马鱼糖尿病模型的优势主要有：斑马鱼胚胎通体透明，可以对特定的组织器官及其变化进行体内活体成像观察；产卵量高、生长周期短，可以获得大量的实验样本；其次，斑马鱼胰腺结构与其他动物胰腺相似，能分泌包括胰岛素在内的多种激素，糖代谢调控机制也与其他哺乳动物相似，这使得斑马鱼非常适用于糖代谢调控研究。目前，利用CRISPR/cas9
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系统和基因编辑技术已构建了大量的斑马鱼血管突变体及血管荧光转基因斑马鱼品系可以有效的简化实验过程，非常适于药物的高通量筛选。
[0005]目前利用斑马鱼已报道糖尿病模型的构建方法：在111mmol/L葡萄糖培养基中培养14天，Pdx1(胰腺和十二指肠同源框1转录因子)基因敲除，继续在4％葡萄糖培养基中培养28天等方式来构建，但该方法构建周期长，模型不够稳定，且效果不佳。

技术实现思路

[0006]鉴于以上技术问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种斑马鱼糖尿病血管病变模型的构建方法，包括以下步骤：将受精后发育1d
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5d的斑马鱼胚胎在混合液中处理30～96h；
[0008]其中，，所述混合液是由质量分数均为3～4％的葡萄糖溶液和蔗糖溶液按照体积
比1∶1配制而成，或是由质量分数均为3～4％的葡萄糖溶液和果糖溶液按照体积比1∶1配制而成。
[0009]优选地，所述发育时间为2.5d。
[0010]优选地，所述葡萄糖溶液和所述蔗糖或果糖溶液的质量分数均为3.5％。
[0011]优选地，所述处理时间为30～36h。
[0012]本专利技术还提供了根据上述构建方法得到的斑马鱼糖尿病血管病变模型在血管疾病研究中的用途.
[0013]优选地，所述斑马鱼糖尿病血管病变模型用于开发糖尿病血管病变药物。
[0014]优选地，所述糖尿病血管病变是血管梗阻和/或血管增生。
[0015]对比现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0016]1、本专利技术提供的构建方法，利用受精后发育1d
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5d天的斑马鱼胚胎在质量分数3～5％葡萄糖溶液和质量分数3～5％蔗糖/果糖溶液的混合液处理30～96h，就可以观察到明显的血管病变表型，且模型十分稳定，血管病变率可达100％。
[0017]2、本专利技术提供的构建方法，可以使斑马鱼视网膜血管及分支血管出现明显病变和梗阻，在分支血管中还可见增生的血管。
附图说明
[0018]图1是斑马鱼视网膜血管病变情况；A、绿色荧光；B、红色荧光；
[0019]图2是斑马鱼糖尿病分支血管病变情况；A、绿色荧光；B、红色荧光；
[0020]图3是高糖组和对照组血糖浓度；与对照组相比，
***
P<0.001；
[0021]图4是高糖组和对照组糖化血红蛋白浓度；与对照组相比，
**
P<0.01；
[0022]图5是高糖组和对照组一氧化氮浓度；与对照组相比，
***
P<0.001；
[0023]图6是高糖组和对照组甘油三酯浓度；与对照组相比，
***
P<0.001。
具体实施方式
[0024]下面通过结合具体实施案例进一步对本专利技术进行进一步详细说明。各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。这些实施案例所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术而用于限定本专利技术。
[0025]为了更好地理解本专利技术而不是限制本专利技术的范围，在本专利技术中所用的表示用量、时间、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想效果的不同而加以改变。
[0026]实施例1
[0027]构建斑马鱼糖尿病血管病变模型
[0028]使用血管绿色荧光特异性标记和血细胞红色荧光特异性标记的转基因鱼系Tg(flk1:GFP；gata1:DsRed)，斑马鱼系购自中国斑马鱼资源中心，并按照动物保护机构和委员会的协议进行饲养和胚胎收集。成年斑马鱼在产卵后收集胚胎，在28.5摄氏度培养箱培养2.5天，加入质量分数3.5％葡萄糖和质量分数3.5％蔗糖等体积混合的混合液(简称为3.5％高糖)进行处理1.5d，进行共聚焦拍照记录视网膜血管及分支血管梗阻情况，同时以
不含葡萄糖及蔗糖的处理组为对照组。
[0029]观察视网膜可见(图1，图中最右列指的是在血管中血液的情况，是左边两个图的叠加图，flk1:GFP是指绿色荧光标记的血管，即图中A指代部分，gata1:DsRed是指红色荧光标记的血细胞，即图中B指代部分)，在高糖组中绿色荧光标记的血管内皮模糊，红色荧光标记的血红细胞基本消失，说明视网膜血管出现明显病变和梗阻，导致血液不能流通，视网膜血细胞消失。
[0030]观察分支血管可见(图2，图中最右列指的是在血管中血液的情况，是左边两个图的叠加图，flk1:GFP是指绿色荧光标记的血管，即图中A指代部分，gata1：DsRed是指红色荧光标记的血细胞，即图中B指代部分)，原本血流通畅的血管出现明显梗阻情况，并且血细胞不能正常进入分支血管中运输。并且在高糖处理后出现了很本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼糖尿病血管病变模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将受精后发育1d
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5d的斑马鱼胚胎在混合液中处理30～96h；其中，所述混合液是由质量分数均为3～4％的葡萄糖溶液和蔗糖溶液按照体积比1∶1配制而成，或是由质量分数均为3～4％的葡萄糖溶液和果糖溶液按照体积比1∶1配制而成。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，斑马鱼胚胎在混合液中处理前发育时间为2.5d。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆辉强，黄勇，彭宇阳，田贵游，罗强，卢晨，
申请(专利权)人：陆辉强，
类型：发明
国别省市：