镁离子在防治水生病毒感染中的应用制造技术

本发明专利技术公开了镁离子（Mg

【技术实现步骤摘要】
镁离子在防治水生病毒感染中的应用


[0001]本专利技术属于水产养殖
，具体涉及镁离子的用途，含有镁离子的化合物可用于制备预防或治疗水生病毒(尤其是GCRV或SVCV)感染的药物或添加剂。

技术介绍

[0002]镁离子是维持神经、肌肉和心脏功能的重要离子之一。镁离子的生理功能主要包括：(一)通过抑制突触的乙酰胆碱释放，阻止神经系统及肌肉的信号传导，具有镇静作用；(二)作用于周围血管系统，使血管扩张，起到降低血压的作用；(三)作为多种酶的催化剂参与到物质代谢和能量代谢过程中，如磷酸酶、磷酸化酶、胆碱酯酶、羧化酶、激酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等等；(四)作为重要组分存在于体内，如分布于骨骼和牙齿中，组成磷酸镁盐，或在血浆中以游离镁离子形态存在，参与多种生理活动。目前，镁离子在抗病毒过程中扮演的角色尚不清楚，尚未有报道将镁离子应用于水生动物病毒性疾病防治。
[0003]鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)属弹状病毒科，水疱病毒属，是一种单股负义链RNA病毒。SVCV引起的鲤春病毒血症(SVC)是一种具高传染性、高致死性的水产疾病，能够造成巨大的经济损失。目前关于SVCV的研究较为丰富，药物研究较多，但仍然缺乏行之有效的防治手段，尚无商品化的特效药。预防方面，SVCV的疫苗开发目前尚处于探索阶段，尚未研发出保护率、成本、接种方式三项均满足规模化生产，能够实现市场投放的疫苗。因此，在当前的研究背景下，寻找高效安全的药物仍是SVCV防治的首选。
[0004]草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，属呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属。GCRV引起的草鱼出血病是危害草鱼养殖产业的主要病毒性疾病。目前，针对GCRV的防治方式主要聚焦于疫苗研究。随着基因工程疫苗研制的发展，以亚单位疫苗和核酸疫苗为代表的各类草鱼出血病疫苗相继出现。但是疫苗的大规模生产应用仍然受到制约，主要是因为疫苗专一性强的特性使其无法应用于易变异的病毒。基于此，找寻具有良好抗病毒效果的抗GCRV药物相比于使用疫苗具有显著的优势。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供镁离子在防治水生病毒感染中的应用，镁离子能够显著抑制鱼类离体培养细胞中病毒相关基因(SVCV相关基因g、l、n、p及GCRV相关基因S6、S9)的转录，抗病毒实验证实镁离子对于SVCV与GCRV病毒感染起到保护作用，含有镁离子的化合物能够用于制备防治水生病毒(尤其是SVCV与GCRV)感染的药物或添加剂。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]镁离子在防治水生病毒感染中的应用：在本专利技术的具体实施例中，感染SVCV的EPC细胞系或感染GCRV的CIK细胞系在加入20mM MgCl2处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，MgCl2处理之后，EPC和CIK细胞中病毒相关基因(SVCV相关基因g、l、n、p及GCRV相关基因S6、S9)的表达被显著抑制，EPC细胞中SVCV病毒的N、P、G蛋白表达水平显著降低。
[0008]本专利技术实施例中选取的两种鱼类细胞系分别是来源于SVCV和GCRV重要宿主的细胞系，因此通过建立两种细胞感染病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知镁离子适用于水生病毒(尤其是SVCV或GCRV)的病毒防治。
[0009]含有镁离子的化合物作为预防或治疗SVCV或GCRV病毒感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，防治效果佳的优点。
附图说明
[0010]图1为MgCl2对SVCV与GCRV 873感染细胞的影响。
[0011]图2为MgCl2对细胞中SVCV与GCRV 873病毒基因转录水平的影响。
[0012]图3为MgCl2对细胞中SVCV病毒蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
[0013]实施例1：MgCl2对SVCV与GCRV 873感染细胞的影响
[0014]抗病毒实验用于检测SVCV与GRCV病毒在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。CIK细胞用于检测GCRV病毒滴度，EPC细胞用于检测SVCV病毒滴度。取生长状态良好的细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种MOI＝10的SVCV于EPC细胞或接种MOI＝1的GCRV于CIK细胞，同时加入20mM MgCl2处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。结果如图1所示，20mM MgCl2处理后的感染病毒细胞中，细胞病变显著减少。
[0015]实施例2：MgCl2对SVCV与GCRV 873病毒基因转录的影响
[0016]检测感染SVCV或GCRV 873之后的细胞用20mM MgCl2处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法及病毒滴度接种病毒并进行药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用TRIzol(Invitrogen)裂解细胞沉淀后提取细胞总RNA，由GoScript逆转录试剂盒(Promega)逆转录得到cDNA。通过qPCR检测病毒相关基因的转录水平，包括GCRV 873相关基因S6、S9，SVCV相关基因g、ln和p，相关方法参照文献
[1]。结果表明：20mM MgCl2处理后，细胞中SVCV病毒相关基因(包括g，l，n，p)及GCRV 873相关基因(包括S6、S9)的转录水平显著下降。
[0017]实施例3：MgCl2对SVCV病毒增殖的影响
[0018]检测感染SVCV之后的细胞用20mM MgCl2处理后，细胞中病毒相关基因的表达情况。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，PBS润洗一遍后放入
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80℃冰箱保存；向冰冻保存的细胞沉淀中加入适量RIPA弱裂解液，置于4℃裂解1小时，使细胞充分裂解；吸取细胞裂解物至新的1.5mL离心管中，样品加入1/4体积的5
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SDS Sample Buffer，涡旋混匀，100℃沸水浴10min，置于冰上备用。使用Western Blot实验检测MgCl2处理后SVCV蛋白表达水平(核蛋白N、磷酸化蛋白P、糖蛋白G)，相关方法参照文献
[2]。实验结果表明，20mM MgCl2处理后，细胞中SVCV病毒的N、P、G蛋白表达水平显著降低(图3)。
[0019]参考文献
[0020][1]ZHOU X Y,LU L F,LI Z C,et al.Temperature effects on SVCV propagation and the related IFN response in zebrafis本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含有镁离子的化合物在制备防治水生病毒感染的药物或添加剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水生病毒为草...

【专利技术属性】
技术研发人员：李卓聪，李顺，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：