一种提高BacillomycinD发酵产量的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，通过添加生长因子VC，来提高Bacillomycin D产量。在本发明专利技术方法中，在发酵培养基中添加VC，可提高Bacillomycin D合成酶基因的相对表达量，促进氨基酸前体合成途径中关键酶基因转录，促进了degQ、comA、comP、comQ、sigM和spo0A等参与次级代谢产物合成的正调控信号因子的表达量上调，同时下调了一些负调控因子如rapC和abrB，使Bacillomycin D的产量提升至对照组的1.44倍；同时本发明专利技术方法成本低、操作简单方便，可以有效降低脂肽的生产成本、提高生产效率，有望用于大规模生产应用。有望用于大规模生产应用。有望用于大规模生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵领域，涉及一种提高BacillomycinD发酵产量的方法。

技术介绍

[0002]杆菌霉素D(Bacillomycin D)属于伊枯草菌素(Iturin)家族，是由枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌属微生物通过非核糖体途径合成的一类脂肽物质，由脂质和肽两部分构成，脂质部分为β
‑
氨基脂肪酸链(C
11
‑
C
17
)，肽段氨基酸序列为L
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Asn、D
‑
Tyr、D
‑
Asn、L
‑
Pro、L
‑
Glu、D
‑
Ser和L
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Thr，两部分通过苏氨酰
‑
β
‑
氨基键连接。Bacillomycin D对黄曲霉菌、赭曲霉菌、匍枝根酶菌等病原真菌具有很强的抑制效果，有潜力成为高效安全的食品防腐剂，应用于食品和粮食的防腐。
[0003]然而，利用基础发酵培养基对野生菌枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)进行发酵，Bacillomycin D产量较低。研究人员对基础培养基进行优化，以菊糖作为碳源，能显著提高Bacillomycin D的产量，分批补料发酵后产量更是提高了3.12倍，但优化后的培养基成本较高，不利于推广Bacillomycin D在防治粮食真菌污染等方面的应用；另外，如中国专利申请第CN109022474A和CN109136250A，对参与Bacillomycin D合成的信号因子进行过表达，也能显著提高其产量，但是基因层面操作复杂。
[0004]检索暂未发现通过添加生长因子VC提高Bacillomycin D产量的报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法。本专利技术中Bacillomycin D产量最低可以提高27％以上，在最优VC添加量的情况下，产量可提高44％；而且VC成本低廉、容易获取，非常适用于大规模生产应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，在发酵初期，向发酵培养基中转接产Bacillomycin D的芽孢杆菌种子液的同时，添加生长因子VC，即可。
[0008]该方法中，本专利技术生长因子VC的添加促进了Bacillomycin D合成酶表达基因的上调，同时也促进了一些参与次级代谢产物合成的信号因子的表达量上调，使得Bacillomycin D的产量得以提高。
[0009]优选的，所述的VC添加量为0g/L
‑
0.75g/L，更优选VC添加量为0.6g/L。
[0010]当VC添加量为0.6g/L时，Bacillomycin D的产量可以提升至对照组的1.44倍。
[0011]优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
[0012]更优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943。
[0013]其中，因鉴定技术的进步，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ后更名为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)fmbJ，因此在本申请中，无论是枯草芽孢杆菌fmbJ还是解淀粉芽孢杆菌fmbJ，都实为保藏号CGMCC No.0943的这株菌。
[0014]具体的，所述方法包括如下具体步骤：
[0015](1)取枯草芽孢杆菌fmbJ进行平板培养；
[0016](2)将步骤(1)中的枯草芽孢杆菌fmbJ转接至种子培养基中，进行种子液培养；
[0017](3)将步骤(2)中的种子液转接至发酵培养基中，同时向发酵培养基中添加生长因子VC，进行发酵培养制备抗菌脂肽Bacillomycin D。
[0018]优选的，所述的种子培养基为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0
‑
7.2。
[0019]优选的，种子液培养条件为37℃，180rpm，培养至OD600达0.8
‑
1.0。
[0020]优选的，步骤(2)培养时间约为3h。
[0021]优选的，所述的发酵培养基为：葡萄糖20.0g，L
‑
谷氨酸5.0g，酵母浸膏1.0g，KH2PO
4 0.5g，MgSO4·
7H2O 0.5g，KCl 0.5g，CuSO4·
5H2O 0.15mg，FeSO4·
7H2O 1.2mg，MnSO
4 5mg，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，发酵条件为：33℃，180rpm，72
‑
150h，优选为72
‑
120h，更优选为120h。
[0022]本专利技术还保护VC在提高抗菌脂肽Bacillomycin D产量方面的应用。
[0023]其中，VC的添加浓度为0g/L
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0.75g/L。
[0024]有益效果
[0025]本专利技术采用在基础发酵培养基中添加生长因子VC来促进Bacillomycin D的产量，VC通过上调Bacillomycin D合成酶基因的表达，促进脂肽的合成，此外VC还能上调一些与枯草芽孢杆菌生长代谢密切相关的信号蛋白的表达，如能调控Iturin A合成的信号蛋白degQ、能调控芽孢合成和抗菌物质分泌的spoθA以及双组分调节系统comA
‑
comP等，下调一些不利于脂肽合成的信号因子如rapC和abrB等。经实验验证，本专利技术中Bacillomycin D产量最低可以提高27％以上，在最优VC添加量的情况下，产量可提高44％。该方法制作简单、成本低、操作方便，可以有效降低脂肽的生产成本、提高生产效率，有望用于大规模生产应用。
附图说明
[0026]图1为VC对Bacillomycin D产量的影响；
[0027]图2为外源添加VC对Bacillomycin D合成酶基因相对表达量的影响；
[0028]图3为外源添加VC对氨基酸前体合成关键酶相对表达量的影响；
[0029]图4为外源添加VC对Bacillomycin D合成相关信号因子的相对表达量的影响；
[0030]图5为外源添加生长因子VB1、VB12、硫辛酸、VK1、VB2、VH、VB6、和VPP对Bacillomycin D产量的影响。
具体实施方式
[0031]下面结合实例对本专利技术做进一步说明，下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，在发酵初期，向发酵培养基中转接产Bacillomycin D的芽孢杆菌种子液的同时，添加生长因子VC，发酵培养即可。2. 根据权利要求1所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述的VC添加量为0 g/L
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0.75 g/L，优选VC添加量为0.6 g/L。3. 根据权利要求1或2所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。4. 根据权利要求3所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943。5. 根据权利要求4所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：（1）取枯草芽孢杆菌fmbJ进行平板培养；（2）将步骤（1）中的枯草芽孢杆菌fmbJ转接至种子培养基中，进行种子液培养，种子液培养条件为37℃，180 rpm，培养至OD600达0.8
‑
1.0；（3）将步骤（2）中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：别小妹，张平，陆兆新，周立邦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：