纯化和/或病毒灭活的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质(例如糖蛋白)的纯化和/或病毒灭活的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的组合处理所述蛋白质(例如糖蛋白)的步骤。的组合处理所述蛋白质(例如糖蛋白)的步骤。的组合处理所述蛋白质(例如糖蛋白)的步骤。

【技术实现步骤摘要】
纯化和/或病毒灭活的方法
[0001]本专利技术涉及蛋白质(或蛋白质产品)的纯化方法和/或蛋白质(或蛋白质产品)的病毒灭活方法。本专利技术涉及糖蛋白(或糖蛋白产品)的纯化方法和/或糖蛋白(或糖蛋白产品)的病毒灭活方法。蛋白质/糖蛋白可以是例如在宿主细胞中产生的重组糖蛋白，诸如FSH、hCG或LH。蛋白质/糖蛋白可以是来源于尿的。
[0002]许多糖蛋白用于治疗性治疗。例如，促性腺激素是一类用于治疗不育的糖蛋白。促性腺激素是一组异源二聚糖蛋白激素，其调节雄性和雌性中的性腺功能。它们包括促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。
[0003]从怀孕的和更年期后的女性的尿中提取的FSH和hCG已经在不育治疗中使用了许多年。从尿中提取的FSH和hCG的产生涉及大量尿的收集和处理。
[0004]作为来源于尿的产品的备选方案，重组形式的FSH和hCG是可用的。目前批准的产品(来自Merck Serono的Gonal
‑
F,Ovitrelle；来自MSD的Puregon)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生(表达)。
[0005]本申请人已经开发了重组FSH和重组hCG，两者均在细胞系中表达。来源于细胞系的FSH产品及其生产方法在国际专利申请号PCT/GB2009/000978(公开为WO2009/127826A)和PCT/EP2012/065507(公开为WO2013/020996)中公开。该产品(FE999049)已经在欧洲完成了III期临床试验。来源于细胞系的重组hCG产品及其生产方法在PCT/GB2010/001854(公开为WO2011/042688)中公开。
[0006]本申请人已经开发了可以用于纯化例如在哺乳动物细胞系中产生的重组FSH和重组hCG的技术(例如，WO2009/127826A和WO2013/020996中公开的重组FSH，和WO2011/042688中公开的重组hCG)。
[0007]根据本专利技术，在第一个方面，提供了一种纯化蛋白质[例如，糖蛋白，例如重组糖蛋白，(例如重组的)促性腺激素，(例如重组的)FSH、hCG或LH]的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的组合处理所述蛋白质[例如，糖蛋白，例如重组糖蛋白，(例如重组的)促性腺激素，(例如重组的)FSH、hCG或LH]的步骤。
[0008]所述方法可以包括用辛酸和乙醇的组合处理蛋白质的溶液[例如，在水、缓冲液或其它介质(例如，缓冲液；100 mM乙酸铵，30
‑
50 mM NaCl，pH 9
‑
pH 9.5)中]。所述方法可以包括在pH 6.5至12，例如pH 7.5至10，例如pH 9至9.5处理在缓冲液(例如乙酸铵缓冲液)中的蛋白质(例如糖蛋白)的溶液。
[0009]用辛酸和乙醇的组合处理糖蛋白的步骤可以在酸性pH进行，例如在pH 2至pH 6.5，例如pH 3至pH 6.5，例如pH 4至pH 6(例如pH 5.5
±
0.1)，优选pH 4.5至pH 5.5]进行。使用酸性条件(例如，pH 4
–
pH 6)归因于辛酸活性。辛酸能够通过破坏病毒膜来灭活包膜病毒；这通过辛酸的不带电形式(其能够穿透病毒疏水膜)实现。辛酸在接近其pKa的pH(pH 4.9)是不带电的。在1单位升高的ΔpH(～pH 5.9)下，100％的辛酸分子带负电荷，并且因此对病毒灭活效率较低。
[0010]蛋白质可以是重组蛋白质或来源于尿的蛋白质。蛋白质可以是糖蛋白。蛋白质/糖蛋白可以是促性腺激素，例如FSH、hCG或LH。糖蛋白可以是重组糖蛋白，例如重组促性腺激
素，例如重组FSH、hCG或LH。优选地，蛋白质/糖蛋白是通过以下方法在细胞(细胞系)中产生的重组糖蛋白(例如重组促性腺激素，例如重组FSH、hCG或LH)，所述方法包括在合适的培养基中培养细胞(细胞系)并且从所述细胞(细胞系)和/或所述培养基收获重组糖蛋白(例如，从细胞培养上清中收获重组蛋白质)。所述细胞(细胞系)可以是哺乳动物细胞(细胞系)，例如CHO细胞(系)，细胞(系)，HEK293细胞(系)，HT1080细胞(系)，COS细胞(系)，NOS细胞(系)，SP20细胞(系)等。优选地，细胞(细胞系)是细胞(系)。
[0011]糖蛋白(促性腺激素，FSH，hCG，LH等)，无论它们是尿的或重组的，通常都是培养基中的溶液/悬浮液的形式。如本领域所熟知的，糖蛋白可以作为单一同种型或作为同种型的混合物存在。在本文中，术语蛋白质、糖蛋白、促性腺激素、FSH、hCG、LH等涵盖包含蛋白质、糖蛋白、促性腺激素、FSH、hCG、LH等的溶液或悬浮液。在本文中，术语蛋白质、糖蛋白、促性腺激素、FSH、hCG、LH等涵盖包含蛋白质、糖蛋白、FSH、hCG、LH等的溶液或悬浮液，其中所述蛋白质、糖蛋白、FSH、hCG、LH等作为单一同种型或作为同种型的混合物存在。因此，术语FSH涵盖包含FSH的溶液或悬浮液(例如，其中FSH作为单一同种型或作为同种型的混合物存在)。
[0012]在本文中，短语“用辛酸和乙醇的组合处理蛋白质(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)”意指将辛酸和乙醇二者应用于蛋白质(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)，使得蛋白质(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)同时暴露于辛酸和乙醇二者。因此，该短语涵盖了这样的技术，其中辛酸和乙醇作为混合物或作为两个分离的试剂被添加至蛋白质(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)的溶液中，因此溶液变成辛酸、乙醇和蛋白质(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)的混合物；该短语也涵盖了辛酸和乙醇二者同时作用于蛋白质(糖蛋白，促性腺激素，FSH，hCG，LH等)的其它技术。
[0013]申请人已经意想不到地发现，在酸性pH，用乙醇和辛酸(例如20mM辛酸/30％乙醇的组合)处理含有重组蛋白质/糖蛋白(例如重组FSH，重组hCG)的溶液可以导致一些病毒的变性(导致其灭活)和/或其它病毒和宿主细胞蛋白质(杂质)的沉淀。然后可以将溶液离心或过滤(以去除沉淀的病毒和/或宿主细胞蛋白质，例如使用深度过滤器诸如玻璃过滤器)，使得上清包含纯化的糖蛋白(例如重组FSH，重组hCG)以用于后续的处理和使用。申请人已经发现用乙醇和辛酸处理含有重组糖蛋白(例如重组FSH，重组hCG)的溶液可以(i)灭活包膜病毒；和/或(ii)通过沉淀清除无包膜病毒(沉淀的病毒然后可以通过后续的离心或过滤(通过例如玻璃纤维过滤器)的步骤去除)；和/或(iii)通过沉淀去除宿主相关的蛋白质(沉淀的宿主相关的蛋白质然后能够通过后续的离心或过滤(通过例如玻璃纤维过滤器)的步骤去除)。这种相对简单的处理和过滤方法提供了显著的杂质去除(在该方法中去除了64％至79％的宿主相关的杂质)，而产物糖蛋白损失最小(即产量高)。
[0014]使用辛酸和乙醇(例如在重组FSH和/或重组hCG的纯化/病毒灭活中)具有其它优点。首先，辛酸与乙醇的组合可以缩短纯化过程，因为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化蛋白质的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的组合处理所述蛋白质的步骤。2.一种蛋白质中病毒灭活的方法，所述方法包括用辛酸和乙醇的组合处理所述蛋白质的步骤。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其包括用辛酸和乙醇的组合处理所述蛋白质的溶液(例如在缓冲液中)。4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是糖蛋白。5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是FSH、hCG或LH。6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是重组糖蛋白。7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质(例如糖蛋白)是通过以下方法在细胞中产生的重组蛋白质(例如重组糖蛋白)，所述方法包括在合适的培养基中培养所述细胞并且从所述细胞和/或所述培养基收获所述重组蛋白(例如重组糖蛋白)。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中用辛酸和乙醇的组合处理所述蛋白质在pH 2至pH 6.5，例如pH 3至pH 6.5，例如pH 4至pH 6，例如pH 4.5至pH 5.5进行。10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中辛酸浓度是10mM至30mM辛酸和/或所述乙醇是20％至50％EtOH。11.根据任一前述权利要求所述的方法，其包括：(a)...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹尼，
申请(专利权)人：辉凌公司，
类型：发明
国别省市：