噬菌体环化测定制造技术

本发明专利技术涉及一种用于确定在遗传展示系统上展示的肽配体的环化程度的方法，其中所述肽配体包含在两个或多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的多肽，其包括步骤：将所述遗传展示系统上展示的多肽暴露至所述分子支架，其中所述多肽在所述两个或多个氨基酸残基处包含两个或多个肽反应性基团，其与分子支架在两个或多个支架反应性基团处形成共价键以得到所述肽配体；从所述遗传展示系统中去除未反应的分子支架；将所述遗传展示系统上展示的所述肽配体暴露于第一探针，其中第一探针与肽配体上的第一未偶联的反应性基团结合；以及测量所述肽配体上的第一未偶联的反应性基团。肽配体上的第一未偶联的反应性基团。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】噬菌体环化测定

技术介绍

[0001]环肽能够以高亲和力和靶标特异性与蛋白质靶标结合，因此是用于治疗剂开发的有吸引力的分子类别。实际上，数个环肽已经成功用于临床，例如，抗菌肽万古霉素，免疫抑制药物环孢霉素或抗癌药物奥曲肽(ocreotide)(Driggers等人，Nat Rev Drug Discov 2008，7(7)，608
‑
24)。良好的结合特性是由于肽与靶标之间形成的相对较大的相互作用表面以及环状结构的构象(conformational)柔韧性降低所致。通常，大环结合数百平方埃的表面，例如，环肽CXCR4拮抗剂CVX15(Wu,B.等人，Science 330(6007)，1066
‑
71)，结合整联蛋白αVb3的具有Arg
‑
Gly
‑
Asp基序的环肽(Xiong,J.P.等人，Science 2002，296(5565)，151
‑
5)、或结合尿激酶型纤溶酶原激活物的环肽抑制剂upain
‑
1( Zhao,G.等人，J Struct Biol 2007,160(1),1
‑
10)。
[0002]由于其环状构型，肽大环比线性肽柔韧性差，导致与靶标结合后熵损失较小，并导致更高的结合亲和力。与线性肽相比，降低的柔韧性还导致锁定靶标特异性构象，增加了结合特异性。该效果已经被基质金属蛋白酶8(MMP
‑
8)有效的选择性抑制剂例证了，其中当所述抑制剂的环打开时，失去了对其他MMP的选择性(Cherney,R.J.等人，J Med Chem 1998，41(11)，1749
‑
51)。通过大环化实现的有利的结合特性，甚至在具有一个以上肽环的多环肽中更显著，例如，在万古霉素、乳酸链球菌肽(nisin)或放线菌素中。
[0003]之前不同的研究小组将带有半胱氨酸残基的多肽连接至合成的分子结构上(Kemp,D.S和McNamara,P.E.，J.Org.Chem,1985；Timmerman,P等人，ChemBioChem，2005)。Meloen和合作者使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速且定量地环化至合成的支架上，用于蛋白表面的结构化模拟(Timmerman,P.等人，ChemBioChem，2005)。WO 2004/077062、WO 2006/078161和WO 2018/197893中公开了用于生成候选药物化合物的方法，其中所述化合物是通过将包含半胱氨酸的多肽连接到分子支架上而生成的，所述分子支架例如为三(溴甲基)苯。
[0004]WO 2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。具体地，该文献公开了包含第一和第二反应性基团的多种支架分子，并且使所述支架与其他分子接触以在偶联反应中在支架和其他分子之间形成至少两个键。
[0005]WO 2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和模拟肽。该文献公开了从现有蛋白中提取的各种肽集合的人工合成。然后将这些肽与具有一些引入的氨基酸变化的恒定合成肽组合，以产生组合文库。通过由化学键将这种多样性引入来区分以各种氨基酸改变为特征的肽，为发现期望的结合活性提供了增加的机会。该文献的附图1显示了各种环肽构建体的合成的示意图。该文献中公开的构建体依赖
‑
SH功能化肽，典型地包含半胱氨酸残基，和支架上的杂芳基，典型地包含苄基卤取代基如二
‑
或三
‑
溴苯基苯。此类基团反应以在肽和支架之间形成硫醚键。
[0006]Heinis等人开发了一种基于噬菌体展示的组合方法，以生成和筛选针对目的靶标的双环肽的大型文库(Heinis等人，Nat Chem Biol 2009，5(7)，502
‑
7；另见国际专利申请WO 2009/098450)(图1A)。简而言之，在噬菌体上展示包含三个半胱氨酸残基和两个区的六
随机氨基酸的线性肽(Cys
‑
(Xaa)6‑
Cys
‑
(Xaa)6‑
Cys)的组合文库，并通过将半胱氨酸侧链共价连接至小分子(三(溴甲基)苯)而环化。在对人蛋白酶组织蛋白酶G和血浆激肽释放酶(PK)的亲和力选择中分离出的双环肽具有纳摩尔级的抑制常数。最好的抑制剂PK15以3nM的K
i
抑制人PK(hPK)。几种分离双环肽的氨基酸序列的相似性表明，两个肽环都有助于结合。在最高测试浓度下(10μM)，PK15既不抑制大鼠PK(81％序列同一性)，也不抑制同源人丝氨酸蛋白酶因子XIa(hfXIa；69％序列同一性)或凝血酶(36％序列同一性)(Heinis等人，Nat Chem Biol 2009，5(7)，502
‑
7)。该发现表明双环抑制剂对其靶标具有高亲和力，并且是高度特异性的。WO 2014/140342进一步公开一种用于生产在噬菌体上展示的双环肽的改进的操作方案。
[0007]虽然Heinis等人和WO 2014/140342公开的方法对于修饰展示的肽以产生双环肽是有效的，但不能精确地确定双环肽环化的程度。质谱(图1B)可用于鉴定反应产物，但其不是用于量化环化反应产率的理想工具，因为所得产物的纯化形式并不总是可用于绘制信号强度相对于浓度的标准曲线。此外，当涉及肽配体(例如双环肽)文库(library)时量化更加复杂，因为肽或肽配体的离子化程度取决于氨基酸序列。即使两种不同肽具有相同的浓度，它们的信号强度也可以是非常不同。
[0008]鉴于上述情况，需要开发一种用于确定遗传展示系统上展示的肽配体的环化程度的简单且有效的测定法。特别是，该测定应适用于肽配体文库。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供一种用于确定在遗传展示系统上展示的肽配体的环化程度的方法，其中肽配体包含在两个或多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的多肽，包括步骤：
[0010](a)将遗传展示系统上展示的多肽暴露至分子支架，其中所述多肽在所述两个或多个氨基酸残基处包含两个或多个肽反应性基团，其与分子支架在两个或多个支架反应性基团处形成共价键，得到肽配体；
[0011](b)从遗传展示系统中去除未反应的分子支架；
[0012](c)将遗传展示系统上展示的肽配体暴露于第一探针，其中第一探针与肽配体上的第一未偶联的反应性基团结合；和
[0013](d)测量肽配体上的第一未偶联的反应性基团。
[0014]精确确定环化程度对于优化反应条件(如温度、支架浓度、pH和反应时间)至关重要。这对于开发新的分子支架尤为重要。本专利技术还允许比较不同分子支架的环化效率。此外，本专利技术有助于筛选具有正确环化的特定克隆，这可以有助于选择所需的肽配体。
[0015]未偶联的反应性基团的量、数量和/或比例可以基于探针的性质测量。在某些实施方案中，探针可以直接或间接产生可检测和可量化的信号，从而可以测量未偶联的反应性基团。例如，信号可以是荧光、发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定在遗传展示系统上展示的肽配体的环化程度的方法，其中所述肽配体包含在两个或多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的多肽，其包括步骤：(a)将所述遗传展示系统上展示的多肽暴露至所述分子支架，其中所述多肽在所述两个或多个氨基酸残基处包含两个或多个肽反应性基团，其与分子支架在两个或多个支架反应性基团处形成共价键以得到所述肽配体；(b)从所述遗传展示系统中去除未反应的分子支架；(c)将所述遗传展示系统上展示的所述肽配体暴露于第一探针，其中所述第一探针与所述肽配体上的第一未偶联的反应性基团结合；和(d)测量所述肽配体上的第一未偶联的反应性基团。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一探针包含或可连接至第一信号传导基团，所述第一信号传导基团直接或间接产生第一信号以指示所述肽配体上的所述第一未偶联的反应性基团。3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括在步骤(c)之后将在所述遗传展示系统上展示的所述肽配体暴露至第二探针，其中所述第二探针与所述遗传展示系统结合并且包含或可连接至第二信号传导基团。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二信号传导基团由所述第一信号触发以产生第二信号。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二信号传导基团产生第二信号，所述第二信号触发所述第一信号传导基团产生所述第一信号。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一信号传导基团包含第一光敏剂，其被配置为将环境氧分子转化为单线态氧分子，并且所述第二信号传导基团包含第一化学发光分子，其被配置为被单线态氧分子激发。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二信号传导基团进一步包含第一荧光基团，所述第一荧光基团被配置为被所述第一化学发光分子的化学发光激发。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一未偶联的反应性基团是两个或多个肽反应性基团中的一个。9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一未偶联的反应性基团是两个或多个支架反应性基团中的一个。10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(c)进一步包括在将所述遗传展示系统暴露于所述第一探针之后，用还原剂处理所述遗传展示系统。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述还原剂是TCEP。12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：拜斯科阿迪有限公司，
类型：发明
国别省市：